Angew ：光裂解表面活性剂助力高通量蛋白质组学学术资讯

来源：研之成理

前言：

大家好，今天为大家介绍一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed. 上的文章，High-throughput Proteomics Enabled by a Photocleavable Surfactant1，本文的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。

基于质谱（Mass Spectrometry, MS）的蛋白质组学能够实现大规模的蛋白质定性定量测定研究，这为了解复杂生物体系中蛋白质的结构和功能研究提供新视角。Bottom-Up技术是发展最为成熟的基于质谱的蛋白质组学方法，近年来，随着高分辨质谱仪器的不断更新，Top-Down蛋白质组学研究也取得重大研究进展。然而，如何实现Bottom-Up和Top-Down的高通量分析仍是目前方法开发的重点。样品制备是获取高质量质谱数据的关键，但同样地，样品制备也是最为耗时的部分，若能够实现分析流程的精简则有望实现高通量分析。表面活性剂在样品制备过程中帮助蛋白溶解，特别是组织和细胞中的膜蛋白。但普通的表面活性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）与质谱不兼容，往往需要额外的去除步骤，不仅耗费时间还有可能造成蛋白或是肽段的损失。而目前可与质谱兼容的酸可断裂表面活性剂同样需要线下去除，无法实现自动化；并且强酸条件可能造成翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs）的丢失；更重要的是没有一款酸可断裂表面活性剂适用于Top-Down分析。
葛瑛教授团队最近开发了一款质谱可兼容的光裂解表面活性剂4-己基苯基偶氮磺酸盐（Azo），Azo可以有效地帮助蛋白溶解（膜蛋白），实现快速光降解不干扰后续MS分析，并且在前期研究中已被证明可用于Top-Down组学2。本文首次证明Azo可与Bottom-Up蛋白质组学完全兼容，是一款能够同时用于Top-Dow和Bottom-Up组学分析的一体化多功能表面活性剂。作者采用完整蛋白和肽段直接进样的方法，发现含有Azo的完整蛋白和肽段质谱信号不受影响，而含有酸可断裂表面活性剂RG则会抑制MS信号，证明Azo与MS分析兼容。接着，作者评估了Azo对Bottom-Up分析流程中的一系列影响（图1a）。

图1. Azo在MS分析中的应用。(a)Azo辅助Bottom-Up分析示意图。(b)紫外光降解Azo。(c)Azo的紫外-可见光谱，在305nm处显示最大吸收。(d)紫外-可见光谱监测汞灯（305nm）照射时间与Azo(水中0.1%)降解的关系。(e)SDS-PAGE显示肌红蛋白酶切[0- 1h，Azo(0-0.2%)]。(f) LC-MS分析。
首先是蛋白提取，生物实验中常采用表面活性剂破坏细胞表面的磷脂双分子层，得到细胞裂解液。本文采用single-step Azo提取人胚胎肾293T (HEK293T)细胞蛋白，生成整个细胞裂解液。SDS-PAGE分析表明，Azo蛋白提取方法具有重现性（图2a）。其次是酶切效率。作者分别从简单体系（单个标准蛋白）到复杂体系（细胞裂解液）评估Azo对酶切效率的影响。酶切时间是Bottom-Up分析中最为耗时的部分，若能提高酶切效率，缩短酶切时间，则可以增加分析通量。肌红蛋白Myoglobin（Tyrpsin耐受）酶切结果显示，含有Azo（0.05%, 0.1%, 0.2%）与不含Azo的蛋白酶切0.5h对比发现，不含Azo存在明显的完整蛋白条带（17kDa）（图1e），而含有0.05%Azo的蛋白酶切之后，完整蛋白条带颜色浅，含有0.1%和0.2%Azo基本看不见完整蛋白。酶切时间延长至1h，实验结果相似（图1e, f）。证明Azo可以明显提高蛋白酶切效率。并且标准蛋白混合物酶切结果也同样显示，加入Azo后酶切效率明显提升。随后在HEK293T细胞裂解液中测试Azo的酶切效率，在三组重复的细胞裂解液中，过夜酶切（图2b）和1h（图2c）酶切分别获得910和938个蛋白，过夜酶切共鉴定到1557个蛋白，1h酶切则鉴定到1572个蛋白，并且它们之间具有81% 的重叠（图2d）。结果证明在Azo存在的条件下，1h的酶切时间足以实现细胞裂解液有效酶切。并且将Azo存在条件下的30 min酶切、过夜酶切和Filter Assisted Sample Preparation (FASP)过夜酶切对比发现，Azo过夜酶切获得的蛋白数最多，但值得注意的是，Azo 30min酶切得到的蛋白数量仅比FASP少33个。再次证明Azo辅助蛋白酶切是种高效、可重复的方法，并且不需要多次的离心和线下除盐步骤，大大节省了样品处理时间。

图2. Azo辅助HEK293T细胞蛋白的快速可重复提取、酶切和LC/MS分析 (a) SDS-PAGE显示三组蛋白提取的重现性（M:marker）。三组细胞裂解液过夜酶切和1h酶切之后LC / MS分析和MaxQuant处理之后得到的结果：过夜酶切(b)和1h酶切(c)中重复的蛋白数量。(d)两种酶切结果组合后共鉴定重复蛋白1403个。
最后是Azo降解效率。Azo的最大吸收峰在305nm（图1b, c），采用汞灯（305nm）照射5min就可以实现完全降解（图1d），证明Azo可以实现样品的快速处理。上述实验证明了Azo可以促进蛋白质提取，帮助快速酶切，并在MS分析之前，实现快速紫外光降解，极大地简化了Bottom-Up蛋白质组学分析流程。此外，实验还证明Azo裂解细胞还有助于提高细胞中的膜蛋白组分。作者采用Azo帮助溶解含有完整膜的沉淀蛋白颗粒，以便更有效地分析内在膜蛋白质。实验结果显示与整个细胞提取实验相比，使用Azo提取过夜酶切鉴定的完整膜蛋白增加了6倍以上，30 min酶切鉴定的完整膜蛋白则增加4倍以上。重要的是，实验检测出几个具有超过10个跨膜结构域的蛋白质，证明了Azo可以溶解高度疏水的蛋白质并使其MS分析成为可能。结果表明，Azo可以帮助得到细胞中的膜蛋白组分，并且较长的酶切时间可以提高对内在膜蛋白识别。并且在Azo应用于左心室心脏组织提取蛋白质的Bottom-Up和Top-Down分析显示，Bottom-Up分析中观察到了许多涉及细胞及其代谢过程中的蛋白质，有助于研究疾病相关蛋白；Top-Down则鉴定出现有蛋白的不同形式，有助于丰富样品中获得生物信息。心脏组织的分析结果证明了Azo在Top-Down和Bottom-Up蛋白质组学分析中的前景。综上所述，Azo是一种同时适用于Top-Down和Bottom-Up蛋白质组学分析的多功能表面活性剂。Azo光断裂表面活性剂不仅能够帮助组织和细胞中的蛋白溶解，并且还规避了目前所用表面活性剂的缺点，不需要额外的去除步骤，节约时间成本，极大地促进了样品分析前的高通量处理。并且研究发现Azo应用于Bottom-Up蛋白质组学分析中时，不仅可以用于蛋白提取；还能极大地缩短酶切时间，增加蛋白酶切效率；更重要的是还能实现内在膜蛋白的有效分析。
参考文献[1] Brown, K.; Tucholski,T.; Eken, C.; Knott, S.; Zhu, Y.; Jin, S.; Ge, Y., High-throughput Proteomics Enabled by a Photocleavable Surfactant. Angew.Chem. Int. Ed. 2020.[2]Brown, K. A.; Chen, B.; Guardado-Alvarez, T. M.; Lin, Z.; Hwang, L.; Ayaz-Guner, S.; Jin, S.; Ge, Y., A photocleavable surfactant for top-down proteomics. Nat. Methods. 2019, 16 (5), 417-420.

来源：rationalscience 研之成理

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