NCB | 葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡：胱氨酸调控戊糖磷酸途径依赖和二硫化物胁迫

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癌细胞的代谢重编程使得其高度依赖某些特定营养物质，例如葡萄糖和谷氨酰胺【1】。癌细胞中，葡萄糖代谢通路包括糖酵解，戊糖磷酸途径（PPP）和三羧酸循环。葡萄糖最著名的功能是通过糖酵解提供ATP（Warburg效应）【2】。戊糖磷酸途径以及三羧酸循环途径还能提供生物大分子合成前体。癌细胞代谢重编程的标志之一就是上调葡萄糖转运蛋白GLUT的表达，特别是GLUT1和GLUT3【3】。

半胱氨酸（cysteine）是一种非常重要的氨基酸，它除了参与蛋白合成，还是细胞内谷胱甘肽（GSH）合成的限速前体物，从而影响细胞氧化还原稳态。半胱氨酸本身是还原态，在体外不稳定，两个半胱氨酸极易被氧化形成含有二硫键的胱氨酸（cystine）【4】。大部分癌细胞主要通过胱氨酸转运蛋白system Xc-（由催化亚基SLC7A11和伴侣亚基SLC3A2组成）摄取胞外的胱氨酸，胱氨酸在细胞内被还原成半胱氨酸供细胞利用【4】。近几年来，胱氨酸转运蛋白SLC7A11通过摄取胱氨酸（同时排出谷氨酸钠），促进谷胱甘肽合成进而抑制铁坏死而被熟知（Nature Cell Biology丨甘波谊/李蔚合作组揭示铁死亡在抑制肿瘤中的重要意义）【5】。然而最近一个有趣的发现是，跟它抑制铁坏死的作用相反，在葡萄糖饥饿条件下，高SLC7A11表达反而促进细胞死亡，使得其依赖高浓度葡萄糖供给【6】。对于SLC7A11这把双刃剑，其具体机制还有待研究。

2020年3月30日，美国MD安德森癌症中心甘波谊研究组及其合作者在Nature Cell Biology杂志上发表文章Cystine transporter regulation of pentose phosphate pathway dependency and disulfide stress exposes a targetable metabolic vulnerability in cancer，发现SLC7A11介导的胱氨酸摄取对于具有高SLC7A11表达的癌细胞而言将付出巨大的代价，这需要消耗大量的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH。细胞摄取的胱氨酸由于其低溶解度而具有潜在的毒性，从而迫使高SLC7A11癌细胞将胱氨酸组迅速地还原为可溶性更高的半胱氨酸，但该过程消耗了细胞内大量的NADPH，并使这些细胞高度依赖于戊糖磷酸途径（PPP）。限制向高SLC7A11癌细胞的葡萄糖供应会导致细胞内胱氨酸和其他二硫化物的明显积累，氧化还原系统崩溃和细胞快速死亡，而采取预防二硫化物积累的方法可防止细胞死亡。进一步研究表明，葡萄糖转运蛋白（GLUT）抑制剂选择性杀死高SLC7A11癌细胞并抑制其生长。该研究确定了SLC7A11相关的胱氨酸代谢与PPP之间的偶联关系，并揭示了伴随的代谢脆弱性，可用于靶向高SLC7A11表达癌症的治疗。

首先，研究者们进行了非靶向代谢组学分析，如预期的那样，SLC7A11过表达增加了细胞内半胱氨酸水平，但降低了细胞内谷氨酸以及谷氨酸衍生的代谢物（例如α-酮戊二酸）的水平（图 1a，b）。出人意料的是，增加最明显的代谢物之一是PPP代谢物6-磷酸-葡萄糖酸盐（6PG）（图1a，b），其他PPP代谢产物以及与6PG相关的代谢产物葡萄糖酸盐也增加了（图1b）。后续碳13（13C）或氘（2H）标记的葡萄糖同位素示踪实验也进一步验证了SLC7A11高表达导致细胞内戊糖磷酸途径流量增强，NADPH增加，即葡萄糖代谢通路向戊糖磷酸途径偏移。基于TCGA生信分析和不同癌细胞蛋白印迹实验也显示人类癌症中，SLC7A11基因表达同戊糖磷酸途径基因（G6PD，PGD， TKT，TALDO1等）呈显著正相关性（图1c），包括肺癌，肾癌和肝癌等。并且，高SLC7A11和PPP基因表达的癌症预后更差。

图1：a，过表达SLC7A11比空载（EV）的肾癌786-O细胞内代谢组学分析。b，过表达SLC7A11比EV的786-O细胞内PPP代谢中间物显著增加。c，TCGA分析SLC7A11同PPP基因显著正相关。

那么SLC7A11与PPP之间的代谢联系的机制和生理意义又是什么呢？已知 PPP的一项主要功能是产生胞质NADPH，它提供还原能力来支持还原性生物合成反应并维持细胞氧化还原稳态。如图2a所示，葡萄糖饥饿条件下（-Glc），SLC7A11过表达显著增加了细胞的NADP+ / NADPH比，这表明SLC7A11在葡萄糖饥饿条件下消耗了大量NADPH。在葡萄糖充足的条件下，SLC7A11的过表达并没有明显影响细胞内胱氨酸水平，但是半胱氨酸水平却明显升高，这表明一旦通过SLC7A11导入细胞，胱氨酸就会迅速还原为半胱氨酸（图2b，c）。因此可以推测胱氨酸还原为半胱氨酸过程会消耗大量还原型NADPH。确实，在葡萄糖饥饿条件下，高SLC7A11不仅消耗了大量的NADPH，还会造成胱氨酸大量积累，以及GSH水平降低，同时氧化型谷胱甘肽GSSG，GSSG / GSH比和活性氧自由基（ROS）水平显着增加（图2b-e）。进一步的分析显示，在葡萄糖饥饿的情况下，SLC7A11过表达的细胞中其他二硫化物也会大量积累，例如γ-谷氨酰-胱氨酸和谷胱甘肽-半胱氨酸。这种显著的硫醇氧化还原系统崩溃伴随着在葡萄糖饥饿下过表达SLC7A11的细胞死亡的显着增加（图3f）。为了进一步验证这种假设，后续实验中，相比较于单纯无葡萄糖培养（葡萄糖饥饿）造成的细胞快速大量死亡，同时撤掉胱氨酸（既无葡萄糖又无胱氨酸）令人惊奇地完全逆转了高SLC7A11表达癌细胞内的各种细胞胁迫积累和细胞死亡（图2g-l）。

图2：a-f，过表达SLC7A11或EV的786-O细胞经正常培养（+Glc）和葡萄糖饥饿（-Glc）后细胞各种变化。g-l高SLC7A11表达的UMRC6癌细胞经正常培养（+Glc），葡萄糖饥饿（-Glc），葡萄糖/胱氨酸双饥饿（-Glc-Cystine）和胱氨酸单独饥饿（-Cystine）后细胞各种变化。

由此可以看到，葡萄糖饥饿条件下，高SLC7A11表达的癌细胞内NADPH急剧消耗，二硫化物（胱氨酸，氧化型谷胱甘肽GSSG，γ-谷氨酰-胱氨酸等等）大量积累，ROS也显著积累，这三个胁迫因素都会对细胞生存不利。为了弄清到底是哪个起了决定作用，研究者们通过提供额外NADPH（2-脱氧-D-葡萄糖2DG，一个葡萄糖类似物，进入细胞后不能进行糖酵解，却能进行PPP前几步反应从而提供NADPH），或者利用二硫化物还原剂（β-巯基乙醇，三(2-羧乙基)膦 TCEP）以及二硫化物交换剂（乙酰半胱氨酸NAC, 青霉胺Penicillamine）都能恢复葡萄糖饥饿造成的细胞胁迫和死亡（表1）。意外的是，ROS清除剂TEMPO或者Trolox却只能抑制葡萄糖饥饿造成的ROS积累，而不能降低NADPH消耗、二硫化物累积和细胞死亡，说明ROS本身并不是造成细胞致死的原因（表1）。总的来看，葡萄糖饥饿导致的高SLC7A11癌细胞内NADPH急剧消耗和二硫化物累积可能是细胞致死的关键诱因。当然，因为他们总是同时发生，所以还不能区分到底哪个胁迫最为致命。

接着，研究者们发现确实高SLC7A11表达的癌细胞对葡萄糖转运蛋白GLUT抑制剂KL-11743（纽约Kadmon公司研制的尚未发表的GLUT1/3抑制剂）特别敏感。KL-11743不仅能体外诱导高SLC7A11癌细胞死亡（模拟葡萄糖饥饿），还能抑制细胞成瘤的生长（图3a-c）。另外，肺癌病人来源的移植瘤（PDX）实验也证实，KL-11743能显著抑制高SLC7A11表达的肺癌生长（图3d）。因为大部分癌细胞中GLUT基因都表达上调，未来高SLC7A11表达或许可以作为GLUT抑制剂治疗的筛选标记物（图4）。

图3：a-c，KL-11743处理的高SLC7A11的肺癌NCI-H226细胞（对照sgCtrl，SLC7A11敲除sgSLC7A11）成瘤生长曲线和HE染色。d，KL-11743显著抑制高SLC7A11的病人来源的移植瘤（PDX）生长。

图4：工作模式图

MD安德森癌症中心的刘晓光博士，张义磊博士和纽约Kadmon公司Kellen Olszewski博士为共同第一作者，MD安德森癌症中心的甘波谊教授为通讯作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41556-020-0496-x

制版人：琪酱

参考文献

1, Pavlova, N.N. & Thompson, C.B. The EmergingHallmarks of Cancer Metabolism. Cell Metab 23, 27-47 (2016).

2, Vander Heiden, M.G., Cantley, L.C. & Thompson,C.B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cellproliferation. Science 324, 1029-1033 (2009).

3, Hay, N. Reprogramming glucose metabolism in cancer:can it be exploited for cancer therapy? Nat Rev Cancer 16, 635-649 (2016).

4, Stipanuk, M.H. Sulfur amino acid metabolism:pathways for production and removal of homocysteine and cysteine. Annu Rev Nutr 24, 539-577 (2004).

5, Dixon, Scott J., et al. "Ferroptosis: aniron-dependent form of nonapoptotic cell death." Cell 149.5(2012): 1060-1072.

6, Koppula, Pranavi, et al. "Theglutamate/cystine antiporter SLC7A11/xCT enhances cancer cell dependency onglucose by exporting glutamate." Journal of Biological Chemistry 292.34 (2017): 14240-14249.

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