刘振博士等开发定量超分辨成像诊断运动纤毛疾病

责编 | 酶美

纤毛 (cilia) 是存在于细胞表面的天线状的细胞器。它在人体细胞中普遍存在，并且在信号感知、传递和细胞运动中起着关键的作用。纤毛的结构包括微管构成的骨架轴丝（axoneme），外面包被的细胞膜，底端的基底体 (basal body) 以及分割细胞质和纤毛内腔的过渡区（transition zone）。纤毛根据其结构可以大致分为两类：感知纤毛（primary cilia或者sensory cilia）和运动纤毛（motile cilia）。感知纤毛的轴丝是9个微管对包围的环状结构即9+0结构，运动纤毛除了9个微管对一般还有一个中心微管对即9+2结构，此外运动纤毛还有动力蛋白等结构协助其运动。

图1. 感知纤毛和运动纤毛的结构

纤毛疾病是由于纤毛功能异常引起的遗传性疾病。现在已报道的约有35种纤毛疾病，这些纤毛疾病几乎影响了人体所有的器官。比较常见的症状包括多囊肾、视力退化、肥胖、骨骼畸形和脑部异常。大部分纤毛疾病的发病率都非常低，其中最常见的纤毛疾病是常染色显性遗传多囊肾。根据英国纤毛疾病协会的估计，所有纤毛疾病加起来大约会影响1/1000的人群。由于纤毛疾病的罕见性，并且表型容易同其他疾病混淆，纤毛疾病的诊断极其不易并容易发生误诊。

不动纤毛综合征（primary ciliary dyskinesia，PCD）是迄今为止发现的唯一一种由于运动纤毛障碍引起的遗传疾病。呼吸道粘液-纤毛清除系统（mucociliary clearance）是呼吸系统抵抗外源入侵病原颗粒的第一道屏障，运动纤毛在其中起着至关重要的作用，它通过方向一致的协调的摆动，将病菌颗粒排出。PCD是由于呼吸道表皮的纤毛病变导致的呼吸系统障碍，其临床表现主要有：慢性呼吸道感染、支气管扩张、肺功能逐渐丧失、鼻窦炎、中耳炎。由于运动纤毛在生殖系统和心脏发育过程中的功能，部分患者存在不育，大约一半病人存在心脏转位 (Kartagener 综合征) 。此外由于运动纤毛和感知纤毛功能的重叠，部分感知纤毛疾病的病人也存在PCD的症状，并经常被忽视，例如视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa），口-面-指综合征（Oral-facial-digital syndrome）。

迄今，大约50个已知基因的突变可以导致PCD。准确的PCD的诊断可以及时鉴定出治疗靶点，起始稳定肺功能的治疗，从而减轻疾病导致的社会负担。然而PCD的诊断现在仍依赖于传统的灵敏度有限的方法。例如透射电子显微镜（TEM）和有限基因的基因面板测序（gene panel sequencing）。基于这些方法，仍有～30%的具有临床表型的病人不能得到确诊，有的病人直到成年甚至死后尸检才被确诊。

近日，Science Translational Medicine 以封面形式报道了来自多伦多儿童医院Vito Mennella和Sharon D. Dell团队（第一作者刘振博士）开发的基于定量超分辨和机器学习的PCD的诊断方法: A quantitative super-resolution imaging toolbox for diagnosis of motile ciliopathies。该项研究有助于改善和补充现有的诊断策略。

为了定量的比较PCD病人和对照组在细胞水平PCD蛋白的表达差异，该团队首先利用现有的验证过的蛋白的抗体结合三维结构光照明技术（3D-structured illumination microscopy，3D-SIM）生成了PCD的指纹图谱：作者通过细胞刷（cytology brush）从对照和病人鼻腔获取呼吸道表皮纤毛细胞并铺在玻片表面，经常规免疫荧光染色后，他用3D-SIM进行自动化成像。图2展示了由21个蛋白生成的PCD指纹图谱，涵盖了外蛋白动力臂（outer dynein arm）、内蛋白动力臂 (inner dynein arm) 、放射状辐条 (radial spoke) 、连接体-动力蛋白调控复合体 (nexin-dynein regulatory complex)、 屏障过渡区 (transition zone) 、基底体 (basal body) 、分子标尺 (molecular rulers)、轴蛋白组装因子 (axoneme assembly factors) 和中心对 (central pair) 的主要蛋白，可以直接或者间接检测45个PCD基因的突变。

作者接下来利用自主开发的MATLAB程序定量检测纤毛中PCD的表达以及PCD蛋白和纤毛的共定位的变化，证实了该定量方法的可行性以及在验证基因突变中Variants of Unknown Significance（VUS）中的作用。为了进一步自动化检测流程，作者训练了一个基于支持向量机 (support vector machine) 的分类器，并证实机器学习可以用来自动化PCD的检测。

3D-SIM的优势在于快速的多颜色通道的成像，但是受制于分辨率（～100纳米），常规3D-SIM并不能看到蛋白分布的精确细节，基于此作者提出使用随机光学重构显微技术（stochastic optical reconstruction microscopy，STORM，分辨率～20纳米）观察分子标尺 (molecular ruler) 在纤毛中的分布。分子标尺是存在于纤毛骨架轴丝上的重复结构，对维持纤毛的结构和功能有重要作用，其中连接体-动力蛋白调控复合体和放射状辐条会沿着纤毛形成96纳米的重复结构。分子标尺的结构超出了传统荧光显微镜和3D-SIM的解析能力。作者在文中展示了利用STORM观察到的连接体-动力蛋白调控复合体蛋白GAS8和放射状辐条蛋白RSPH4A的96纳米的结构，以及用傅立叶变换探测96纳米的结构。之前衣藻中的研究表明，分子标尺蛋白CCDC39同源蛋白fab59的缺失，会使RSPH4A的96纳米的结构缩短为32纳米，然而哺乳动物中CCDC39的缺失对RSPH4A的影响并不清楚。作者通过对CCDC39缺失病人的RSPH4A蛋白进行STORM成像发现，跟衣藻不同，CCDC39的突变并不会引起RSPH4A 96 纳米标尺的消失，而是导致了外周9个微管对对齐的问题。文章指出STORM会在研究PCD的发病机理方面有贡献，并且相对于cryo-ET（electron cryotomography）由于对样品材料需求较少，有分子特异性，易于操作而更具有应用前景。

图3. 利用STORM研究分子标尺和CCDC39的致病机制

文章最后提出了一个基于3D-SIM检测旋转极性（rotational polarity）的诊断方法。相比感知纤毛，呼吸道运动纤毛只有一个基底足（basal foot），纤毛的协调摆动会导致一个细胞内所有的基底足都指向纤毛摆动的方向。这种基底足指向一个方向的现象叫旋转极性，对纤毛的协调运动和粘液-纤毛清除的效率起重要作用。在PCD病人的细胞中由于纤毛结构异常产生运动障碍，旋转极性丢失，检测旋转极性的变化因此可以作为潜在的诊断PCD的方法。在此作者使用了在空气-液体界面（air liquid interface）上体外培养的多纤毛细胞，多纤毛细胞会在空气-液体界面形成类似呼吸道的伪分层表皮（pseudostratified epithelium）。作者通过标记基底蛋白POC1B和基底足蛋白CENTRIOLIN，使用3D-SIM收集数据，最后测量细胞内所有基底体-基底足的方向对来计算细胞的旋转极性值，结果表明PCD病人的旋转极性均遭到破坏，并且这种方法可以用来区分PCD和另外一种呼吸道疾病，即囊肿性纤维化（cystic fibrosis）。

图5. 利用旋转极性诊断PCD

综上，作者基于定量超分辨成像技术开发了一系列诊断和研究PCD的方法，文章分析了31个病人，利用3D-SIM PCD指纹可以直接诊断21个，剩余10个可以被间接诊断（基因突变会导致PCD指纹内蛋白细胞定位发生变化）。3D-SIM PCD指纹适合用来验证测序中出现的Variants of Unknown Significance（VUS）。不依赖抗体的旋转极性分析可以作为一个通用的PCD筛查办法 。同时，基于STORM的研究也可以对疾病的发病机制提供思路 。

据悉，文章的通讯作者是Sharon Dell 和Vito Mennella，第一作者是刘振，此外Quyhn Nguyen、管清绪、Alexandra Albulescu对本文有重要贡献。刘振博士期间在北京大学孙育杰课题组接受超分辨荧光显微技术的系统训练，于2016年进入多伦多病童医院进行超分辨成像技术在纤毛疾病诊断和应用方面的研究。国内的PCD患者及研究。如果他们有问题可以联系刘振博士zhen.liu@sickkids.ca。