盘点丨分子互作技术如何应用在新冠病毒研究

虽然当前新冠病毒（SARS-CoV-2， Severe Acute Respiratory Syndrome，即严重急性呼吸道综合征冠状病毒II型）已经是全球性大流行了，但是，中国的抗疫之战已经接近胜利。面对大灾大难，咱们就是能一条心战而胜之——咱可不能做 “甩锅川”，更不能扯什么“Herd Immunity（群体免疫）”这样的鬼话。

小编已经开始憧憬着走出家门，沐浴着明媚阳光，看看大自然的花花草草，跟大家伙儿面对面交流了。小编今天就给大家分享一下，疫情爆发至今ForteBio的分子互作技术（生物膜干涉，BLI）给广大的科研工作者提供了哪些帮助。

图片来源：《Lancet》

文章较长，可以mark先，请备好咖啡慢慢看~

• 我国科学家第一个鉴定SARS-CoV-2 S蛋白与宿主受体结合动力学

DOI: 10.1080/22221751.2020.1729069

SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2结合动力学

基于之前对SARS-CoV的认识，中科院武汉病毒所石正丽团队通过病毒侵染细胞证实SARS-CoV-2与SARS-CoV一样，通过病毒表面的刺突蛋白（Spike protein，S蛋白）识别人体内细胞表面的ACE2并侵染宿主细胞。这为其他科研工作的开展奠定了基础。

在1月11日第一条SARS-CoV-2基因序列由复旦大学张永振团队公布以后，1月28日复旦大学应天雷团队发表Emerging Microbes & Infections文章。作者通过合成S蛋白受体结合段RBD结构域的序列真核表达得到S-RBD蛋白。为了验证蛋白的结合活性，使用ForteBio检测了S-RBD与人受体蛋白ACE2结合动力学，证实两者之间的直接结合，且亲和力（affinity）达到了15.2nM。这是全球第一次鉴定出新冠病毒S蛋白与ACE2受体的结合动力学，与SARS-CoV表现出相似的亲和力也意味着两种病毒相近的易感性。

抗体CR3022与SARS-CoV-2- S-RBD结合动力学/CR3022与ACE2的竞争实验

正因为这种相似性，作者选取了已知的针对SARS-CoV S-RBD蛋白的3株中和抗体（CR3022，CR3014和m396）进行动力学检测发现，抗体CR3022与SARS-CoV-2-S-RBD具备很强的的结合力，KD为6.28nM。另外两株则完全不结合。通过后续的竞争实验发现，CR3022并不能阻断病毒与ACE2的受体蛋白的结合。但是鉴于CR3022在SARS-CoV治疗中跟抗体CR3014良好的联用效果，CR3022对SARS-CoV-2来说依然是潜在的中和抗体。（小编提醒大家先记住这个CR3022抗体）

• Cell及Science文章首次揭示SARS-CoV-2 S蛋白结构特征及结合表位差异

DOI: 10.1016/j.cell.2020.02.058 ;

DOI: 10.1126/science.abb2507

冠状病毒的S蛋白暴露于病毒表面并介导病毒进入宿主细胞，因此它是感染后中和抗体的主要靶标，也是药物开发和疫苗设计的重点。2月初，来自华盛顿大学的Veesler团队和德州大学奥斯汀分校McLellan团队分别发表了Cell和Science文章，对SARS-CoV-2的S蛋白进了结构解析及并比较其与SARS-CoV差异的分析。

Veesler团队通过病毒侵染实验验证了人ACE2可调节SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞进入，以此确定ACE2是SARS-CoV-2的功能受体。这跟前文提到的中科院武汉病毒所的结论是一致的。作者首先对SARS-CoV-2 和2002-2003年SARS疫情相关的SARS-CoV分离株的S蛋白的结构域B与人ACE2结合的亲和力进行了比较，表明SARS-CoV-2 S_B与ACE2具有较高的结合亲和力（KD：1.2nM vs 5nM），并且解离速度稍慢一些（koff：1.6 x 10^-4s^-1 vs 7.1x10^-4s^-1）。一定程度上解释了SARS-CoV-2与SARS-CoV具有相近的较强的感染和传播能力。

有趣的是，McLellan团队也做了类似的工作，采用另一种分子互作技术（表面等离子共振，SPR）检测了SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2的KD为15nM，而SARS-CoV S蛋白的RBD-SD1结构域与ACE2的KD为325.8 nM。两者相差20倍。这与Veesler，应天雷以及更多研究人员的实验结论看起来不一致，两种病毒蛋白与受体之间的结合差异似乎没这么夸张。需要指出的是，McLellan团队并没有取相同的结构域进行亲和力比较，这个可能是其中一个因素。

S_B结构域顶点“open”状态

比较了亲和力的相似性之后，Cell和Science文章对S蛋白的结构进行了解析，发现SAR-CoV-2和SARS-CoV的S蛋白结构非常相似。S蛋白由S1和S2两个亚基组成，S1负责与宿主细胞受体结合，S2负责病毒包膜和细胞膜融合。SARS-CoV-2 S蛋白的三聚体能够以不同的构象状态存在，其中 S_B结构域顶点处的 “open” 状态对于受体的结合是必需的，从而启动融合构象变化。氨基酸序列比对表明，SARS-CoV-2和SARS-CoV的 S_B蛋白域存在75%序列一致性，RBD区域的14个关键结合位点中8个没有变化，6个发生突变。这些关键结合位点的改变与受体结合能力的差异，以及是否影响SARS-CoV-2宿主趋向性和感染能力值得更多研究。

此外，Science文章中尝试用ForteBio筛选相应的中和抗体，发现对SARS-CoV有效的3株中和抗体（S230，m396和80R），均无法结合SARS-CoV-2 S蛋白。而Cell文章中，Veesler团队发现SARS-CoV S蛋白免疫小鼠提取的多克隆抗体可以有效中和SARS-CoV-2 S假病毒进入宿主细胞。这既说明两种病毒的感染机制的相似性，又表明中和抗体的表位可能不局限于S1亚基的RBD区域，也可能与S1亚基其他保守区域或者更为保守的S2亚基有关。

以上这些研究提示S蛋白中存在保守性的和可访问的表位，这将为药物的研发，中和抗体筛选以及疫苗设计工作提供有利的支持。

• 荷兰科学家获得第一个中和SARS-CoV-2的全人源单克隆抗体

DOI: https://doi.org/10.1101/2020.03.11.987958

针对GP蛋白的中和抗体在埃博拉病毒治疗和预防中发挥了重要作用，因此，新冠病毒的广谱中和抗体开发是当下研究的热点之一。3月初，荷兰乌得勒支大学的Bosch团队发文称，获得了一株针对新冠病毒甚至可能其他冠状病毒均有效的全人源单克隆抗体。

图片来源：Harbour Biomed官网

研究人员采用H2L2全人源小鼠平台，用了三种冠状病毒（SARS-CoV，MERS-CoV，HCoV-OC43）的S蛋白免疫小鼠，筛选出可以同时结合SARS-CoV和SARS-CoV-2 S蛋白的S1_B 结构域（S蛋白的结合ACE2受体部分所在结构段）的全人源单克隆抗体47D11。通过ForteBio的动力学检测发现， 47D11单抗与两种病毒S蛋白的不同结构域（胞外Secto和S1_B ）均能较强结合，与S1_B 的亲和力非常接近（16.1nM vs 9.56nM）。

47D11单抗与两种蛋白不同结构域结合能力比较

随后，研究人员分别用假病毒和真病毒进行空斑减少中和试验（PRNT)，发现47D11单抗展现出一致的病毒中和抑制效果。47D11单抗中和SARS-CoV和SARS-CoV-2的IC50分别为0.19 和 0.57 μg/mL。但是，作者进一步研究发现，47D11单抗却不能阻断SARS-CoV S蛋白和ACE2的结合。

47D11单抗对真假病毒的中和实验

文章推测，这表明47D11单抗可能结合的是S1_B 亚结构域中更保守的部分，而这部分更保守的区域参与病毒的进入宿主细胞的过程。虽然47D11不能阻断病毒与ACE2的结合，但是却结合S1_B 亚结构域后阻断病毒S蛋白与细胞的融合，从而起到中和病毒的作用。

这就是全球首次报道的最有说服力的中和新冠病毒的全人源单克隆抗体，这不仅可能用于新冠病毒的诊断检测，而且为新冠病毒肺炎的治疗提供了清晰的前景。

• 知名研究所发现SARS-CoV-2 S蛋白的隐秘的保守抗原结合表位

DOI: https://doi.org/10.1101/2020.03.11.987958

就在最近几天，美国Scripps Research的Wilson团队和Walter Reed Army Institute of Research的Modjarrad团队接连发文，受到前文提到的复旦大学应天雷团队文章的启发，他们对SARS-CoV的中和抗体CR3022（对，就是小编前文提醒各位的应天雷团队曾经验证的那个抗体）以及其与SARS-CoV-2的S-RBD结合复合物进行了结构解析，并对其中的保守的结合位点进行了深入分析。

Modjarrad团队首先用ForteBio对已经报道过的人源抗体CR3022以及鼠源抗体420CD的结合活性进行验证，表明两个抗体可以有效地结合SARS-CoV-2 S-RBD，亲和力均为nM水平。表位竞争实验发现两株抗体可以相互阻断其与S-RBD的结合，却均不能阻断ACE2与S-RBD的结合。同时，作者选取了两株蝙蝠源的SARS病毒Rs4231和Rs4874，中和抗体CR3022均可以很好地识别两株病毒的S蛋白，说明抗体CR3022具有非常好的种属交叉活性。

CR3022及240CD与SARS-CoV-2 S-RBD动力学及其与240CD的竞争

CR3022不能阻断ACE2；

可中和其他蝙蝠源SARS-CoV

Wilson团队则通过比较CR3022抗体的完整IgG与Fab段与S-RBD的结合动力学，发现完整IgG时CR3022与SARS-CoV-2以及SARS-CoV均可以表现出非常强的结合能力（nM级）。当仅Fab段时CR3022与SARS-CoV-2的显著结合弱于SARS-CoV。这可能跟S蛋白的三聚体结构的不同构象形态有一定的关系。

Modjarrad团队通过对CR3022与SARS-CoV-2 S-RBD复合物晶体解析，发现CR3022抗体结合在一个以S-RBD的氨基酸残基（377~386）为中心的抗原表位区域上。并且跟SARS-CoV以及MERS-CoV比较可发现这里面存在不一样的结合位点（P384和T430）。通过进化树分析，这个表位本身在β属冠状病毒中时极度保守的。这就进一步证实了前面CR3022抗体可以中和蝙蝠源的SARS，是因为存在相同的表位。另外，作者将该表位中的P384氨基酸位点突变为glycan sequon，发现CR3022与240CD抗体均不能结合S-RBD。说明两株抗体拥有同样的结合位点，进一步证实该表位的保守以及该位点的重要性。

CR3022与SARS-CoV-2 S-RBD复合物结构       CR3022的结合表位（蓝色区域）

为了进一步比较CR3022抗体的结合表位与ACE2结合表位的差异，Wilson团队和Modjarrad团队分别通过结构建模发现，CR3022抗体与S-RBD的结合表位跟ACE2的结合表位是完全不重叠的。并且，Wilson团队发现，可能需要S蛋白三聚体中至少两个及以上的RBD区域形成“up”状态的构象，CR3022抗体的结合表位才能完整暴露出来。Modjarrad团队也认为一个RBD处于“up”构象时，抗体CR3022的Fc段会遮挡住部分S-RBD的N端结构域重叠，当两个或三个RBD均为“up”状态时，CR3022的结合表位是可以完全进入的。之前的研究表明，这个RBD区域的“up”构象对于病毒识别ACE2受体，以及与细胞进行融合可能是至关重要的。

CR3022与ACE2在S-RBD上的结合表位比较

（左图来自Wilson团队，右图来自Modjarrad团队）

以上研究内容很好地解释了应天雷团队发现的问题，即CR3022抗体能够结合SARS-CoV-2 S-RBD，但是却不能阻断ACE2与S-RBD的结合。而前文提到CR3022在与另一株强力中和抗体CR3014联用时，可以对SARS-CoV起到非常好的治疗作用。CR3022在其中扮演的可能就是协同作用。这个新的表位和ACE2受体结合位点将为药物设计和疫苗开发以及联合治疗开拓新的思路。

ForteBio分子互作平台以其高灵敏，高通量，快速简便，适合粗样品，无污染风险，低实验成本等特点，在这个疫情愈发严重的节点，在病毒的结构分析，致病机制，中和抗体筛选，表位分析，药物设计等领域高效输出各种高质量数据。相信会有更多的好文章，更深入地研究，帮助我们打赢抗疫之战！

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2. P. Zhou et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579, 270–273 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7

3. A.C. Walls et al. Unexpected receptor functional mimicry elucidates activation of coronavirus fusion. Cell. 2019;176(5):1026-1039. e15

4. D. Wrapp et al., Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science 10.1126/science.abb2507 (2020).

5. A. C. Walls et al., Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. Cell 10.1016/j.cell.2020.02.058 (2020).

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8. M. Joyce et al,. A Cryptic Site of Vulnerability on the Receptor Binding Domain of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.15.992883

制版人：半夏