近年来，mRNA依赖的蛋白质替换和CRISPR/Cas介导的基因编辑/修复在多种疾病治疗方面有着极大的应用价值，但是体内安全、高效的递送是制约其应用的最大障碍【1-4】。由于制备过程简易和可以重复给药的特点，非病毒纳米颗粒展现出了非常好的应用前景【1】，其中脂质纳米粒（Lipid Nanoparticles，LNPs）在RNA治疗中成绩最为突出，2018年8月，FDA批准的第一款siRNA药物（Onpattro）正是基于MC3 LNPs的递送技术【5】。与siRNA药物相似，当前mRNA和CRISPR/Cas的递送LNPs大多数是肝脏靶向的，肝脏以外的有效递送问题亟待解决。高通量化学合成和筛选的方法可以得到靶向肝脏以外的LNPs，如肺和脾【6-8】，但此方法工作量大、耗时长、并且具有一定的盲目性，而且很难真正给出具有普适性的LNPs设计原则。2020年4月6日，来自德克萨斯大学西南医学中心Daniel J. Siegwart教授团队（共同一作为程强和魏妥博士）在Nature Nanotechnology上在线发表了题目为“Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing”的研究成果，报道了器官选择性mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑的研究成果，提出了对靶向递送LNPs的普适性设计原则（SORT）。SORT可以对LNPs进行精准地、可预测地优化，使其快速实现肝、肺和脾的mRNA靶向递送和CRISPR/Cas9介导的基因编辑（图1），预计该结果将会极大程度地推动mRNA治疗和基因编辑领域的发展，尤其是肝脏以外的靶向治疗。 图1. SORT技术实现了mRNA的器官选择性递送。该实验室的前期研究结果表明，两性（同时带有正、负电荷）脂质组成的LNPs会非特异递送mRNA到达多种器官中（肝、肺）【6】；另一研究结果显示通过调整脂质体的表面电荷可以递送mRNA到免疫细胞中（肺、脾）从而介导肿瘤的免疫治疗【9】。基于此，作者猜想LNPs内部的电荷平衡可能是调控器官选择性递送的关键，为了验证该想法，作者选择了该实验室已优化的肝靶向递送LNPs（名为mDLNP）【10】为研究对象，在原有的4组分中引入带有电荷的第5种脂质（SORT脂质）以便调节LNPs内部的电荷。首先选择了最为常用的阳离子DOTAP脂质分子，随后构建了一系列不同组成比例的DOTAP mDLNP，通用公式为5A2-SC8/DOPE/Chol/PEG/DOTAP=15/15/30/3/X，这里X的变化使得DOTAP含量可以从0%到100%。接着，作者通过静脉给药在小鼠内体进行了mRNA的递送研究。图2. DOTAP在mDLNP中占的比例决定了mRNA的器官选择性递送。通过静脉注射低剂量（0.1mg/kg）荧光素酶mRNA（Luc mRNA）的纳米颗粒后，DOTAP mDLNP成功转染了小鼠体内的脏器。令人惊讶的是，随着DOTAP的比例不同，表现出了器官选择性mRNA的递送效果（图2）。0%为肝脏特异性转染、10%-15%为脾脏转染最高、之后随着DOTAP比例越高，肺部靶向性越好，且50% DOTAP呈现出最好的肺部转染效果。鉴于此结果，作者随后用相同的策略研究了阴离子SORT脂质（18PA）对mRNA的影响，结果显示引入5%到40%的18PA mDLNP特异性递送mRNA到了脾脏（图3），而在肝和肺没有检测到任何荧光素酶的表达。这些结果表明，LNPs的内部电荷的确在器官选择性递送中扮演了重要的角色。作者将这种快速筛选器官选择性LNPs的方法命名为SORT。 图3. 阴离子18PA脂质改造后的mDLNP实现了脾脏的特异性mRNA递送。为了验证SORT的普适性，首先，利用相同的策略研究了其他类型的LNPs，作者选择了MC3 LNPs【11】和C12-200 LNPs【12】，二者均为肝靶向mRNA递送载体的金标准。分别引入DOTAP和18PA脂质以后，均得到了与mDLNP中完全一致的结果，即控制DOTAP的比例使mRNA递送到脾和肺，而18PA的加入成功实现了脾脏的特异性mRNA递送（图4），这些结果说明SORT适用于任何类型的LNPs。值得一提的是，MC3 LNPs已经是FDA批准的siRNA递送载体，通过SORT优化技术，有可能对MC3 LNPs进行快速、高效的改造，从而加速siRNA或者mRNA在肺和脾中的治疗应用；接着，作者尝试了多种不同结构但电荷相同的SORT脂质分子以证明其普适性，阳离子脂质分别使用了DOTAP、DDAB和EPC，阴离子脂质使用了18PA、14PA和18BMP，最终得到了一致的结论。说明，SORT技术不依赖脂质分子的化学结构，而是LNPs内部电荷的平衡；最后，作者尝试把SORT脂质替换为可离子化的阳离子脂质，如，DODAP，C12-200和5A2-SC8分子，这些分子在中性环境中不带有任何电荷，而在酸性条件下可带正电荷。研究结果表明，可离子化的阳离子脂质不会改变器官的选择性递送，依然具有肝脏特异性，但是通过引入20%的SORT脂质显著提高了肝脏的转染效率。至此，作者证明了SORT技术在LNPs优化中的普适性规律，简言之，阳离子SORT脂质可以控制mRNA的脾和肺靶向递送；阴离子SORT脂质可实现mRNA的脾脏特异性递送；而可离子化的SORT脂质可用于增强肝脏mRNA的转染效率。SORT技术的普适性不仅在于SORT脂质的选择上，而且适用于不同类型的LNPs中，更重要的是SORT技术对器官选择性mRNA的递送具有可预测性，无需进行大规模体内外实验筛选，这无疑会加快mRNA在今后治疗中的应用。 图4. SORT技术具有普适性，可以被应用到其他类型的脂质纳米颗粒中，这里选择了MC3 LNPs和C12-200 LNPs为研究对象。
随后，作者分别使用了肝、肺和脾靶向SORT LNPs进行了mRNA递送和基因编辑的应用研究。首先是mRNA介导的器官选择性基因编辑，作者选用了Td-Tomato（tdTom）转基因小鼠，正常状态下，tdTom小鼠只表达本底水平的荧光，当tdtom基因前的终止信号被Cre酶或者CRISPR/Cas9切除后会激活红色荧光的表达，从而方便研究者进行检测。作者分别用肝（20% DODAP SORT）、肺（50% DOTAP SORT）和脾（30% 18PA SORT）靶向LNPs通过单次静脉递送Cre mRNA进行了器官特异性基因编辑，并且通过流式细胞仪技术鉴定了不同细胞类型的编辑效率（图5）。肝实质细胞的编辑效率接近100%，肺部的内皮细胞和上皮细胞的编辑效率分别达到39%和66%，而脾脏的B、T淋巴细胞和巨噬细胞的编辑效率分别为12%、10%和20%。这些研究结果为mRNA介导的器官特异性治疗提供了直接的证据。图5. 器官特异性SORT LNPs通过递送Cre mRNA在tdTom转基因小鼠成功实现了肝、肺和脾的基因编辑，激活了tdTom的表达。
接着，作者从mRNA移步到了CRISPR/Cas9介导的基因编辑。SORT LNPs包裹Cas9 mRNA和sgRNA复合物，在tdTom小鼠中单次静脉给药后，分别在肝和肺脏观察到了明显的红色荧光信号（图6），虽然脾脏的编辑效率不高，但依旧可以观察到明显增加的红色荧光。随后，作者用相同的策略对内源性基因（PTEN）进行了器官特异性的基因编辑，单次给药后在肝和肺部的基因效率可以分别高达14%和15%！为了进一步研究CRISPR/Cas9基因编辑的应用前景，作者使用肝靶向SORT LNPs，采取3次给药的方法对PCSK9进行了基因编辑。基因水平的编辑效率高达60%，而血液和肝脏中PCSK9蛋白的敲除效率达到了100%！这些结果表明器官选择性SORT LNPs可以介导高水平的基因编辑效率，足以达到疾病治疗的目的。图6. SORT LNPs通过共递送Cas9 mRNA和sgRNA在tdTom转基因小鼠和普通C57小鼠中介导了脏器特异性的基因编辑。SORT LNPs在（a，b）tdTom转基因小鼠（tdTom基因）和（c）普通C57小鼠中（PTEN基因）介导的基因编辑；（d-g）肝靶向SORT LNPs介导的肝脏PCSK9基因编辑。
总结而言，本研究创造性的提出了快速优化和筛选器官特异性LNPs的方法，命名为SORT，SORT适用于各种类型的LNPs，可作为通用的设计指导原则，且无需进行大规模体内外实验筛选。SORT LNPs显示出高效的器官特异性mRNA递送和CRISPR/Cas9基因编辑效果，预计将会极大地促进这些领域的研究。https://doi.org/10.1038/s41565-020-0669-61.Hajj, K.A. & Whitehead, K.A. Tools for translation: non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials 2, 1-17 (2017).2.Sahin, U., Karikó, K. & Türeci, Ö. mRNA-based therapeutics—developing a new class of drugs. Nature reviews Drug discovery 13, 759 (2014).3.Sander, J.D. & Joung, J.K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature biotechnology 32, 347 (2014).4.Wang, H.-X. et al. CRISPR/Cas9-based genome editing for disease modeling and therapy: challenges and opportunities for nonviral delivery. Chemical reviews 117, 9874-9906 (2017).5.Akinc, A. et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nature Nanotechnology 14, 1084-1087 (2019).6.Miller, J.B. et al. Non‐viral CRISPR/Cas gene editing in vitro and in vivo enabled by synthetic nanoparticle co‐delivery of Cas9 mRNA and sgRNA. Angewandte Chemie International Edition 56, 1059-1063 (2017).7.Sago, C.D. et al. High-throughput in vivo screen of functional mRNA delivery identifies nanoparticles for endothelial cell gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences 115, E9944-E9952 (2018).8.Fenton, O.S. et al. Synthesis and biological evaluation of ionizable lipid materials for the in vivo delivery of messenger RNA to B lymphocytes. Advanced Materials 29, 1606944 (2017).9.Kranz, L.M. et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature 534, 396-401 (2016).10.Cheng, Q. et al. Dendrimer‐based lipid nanoparticles deliver therapeutic FAH mRNA to normalize liver function and extend survival in a mouse model of hepatorenal tyrosinemia type I. Advanced Materials 30, 1805308 (2018).11.Sabnis, S. et al. A novel amino lipid series for mRNA delivery: improved endosomal escape and sustained pharmacology and safety in non-human primates. Molecular Therapy 26, 1509-1519 (2018).12.Kauffman, K.J. et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano letters 15, 7300-7306 (2015).