PRIMO助力冷冻电镜进行标准化细胞观察
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冷冻电镜（Cryo-EM）是观察细胞内分子构造的有力工具。然而，用冷冻电镜观察细胞样本是具有挑战性的，细胞经常粘附在金属网格框架上，影响最终的成像质量。
图1. 细胞在传统电镜网格中的定位【1】：
（a图）：Hela细胞在标准金网格（覆盖SiO2 R2/1多孔膜）中的冷冻扫描电镜（Cryo-SEM ）图像，准备制作FIB-lamellae。
（c图）：局部放大图：Hela细胞，用GFP标记β-微管蛋白（蓝绿色）和用mCherry标记组蛋白（品红色），种植在标准网格中。
可见用传统方法大多数细胞都粘附在网格的框架上，只有少数细胞有较好的定位（红圈/箭头表示）。
用法国Alveole公司的PRIMO“定制化细胞微环境制备系统”，其无掩模、非接触式的微图案（micropatterning）功能能为您的TEM（Transmission Electron Microscopy，透射电子显微术）和cryo-ET（Cryogenic Electron Tomography，冷冻电子扫描断层成像术）实验提供更好的细胞样本【2】：
（1） 自动化细胞定位：在电镜网格（EM grids）的网眼（mesh）中央进行精准的自动化细胞定位；
（2） 标准化细胞模型：微图案化设计可重复，可进行力学生物学研究；
（3） 电镜网格表面无损伤：微图案化为非接触式UV投射，可保护电镜网格的表面完整性。
PRIMO的LEONARDO软件能检测到电镜网格的网眼，并自动在网眼的中央用PRIMO投射出对齐的微图案。这样就能保证细胞都定位在网眼的正中央，有利于电镜的成像观察。
图2.（a图）：用PRIMO无掩模光照图案法（photopatterning）得到的，在多孔碳电镜网格中的ECM蛋白微图案。电镜网格为200目的金格栅条，比例尺为50µm。
（A-I图）：上皮PtK1细胞，被限制在电镜网格中的罗丹明-纤维连接蛋白（红色）组成的微图案上，该微图案由PRIMO无掩模光照图案法得到。比例尺为10µm。【3】
图3. 细胞在PRIMO处理过的网格中的定位【1】：
（b图）：在金网格的网眼中加上一个直径20µm的纤维连接蛋白组成的微图案。拍摄Hela细胞在这个微图案化的网格中的图像（白色的杂质为冰晶的污染物），准备制作FIB-lamellae。
（d图）：局部放大图：Hela细胞，用GFP标记β-微管蛋白（蓝绿色）和用mCherry标记组蛋白（品红色），种植在微图案化的网格中。
可见在PRIMO处理过的网格中，所有细胞都定位在网眼的正中央（红色方框）。
图4. PRIMO对网格中央微图案化后，可保证细胞的定位适合进行FIB milling和cyro-ET成像【1】：
（e图）：对（图3，b图）中的细胞进行FIB浅角度成像，黄色长方体表示准备milling的微图案。
（f图）：由（e图）中的细胞形成的最终的晶片（FIB-lamellae）。
（g图）：是（e图）中细胞的核周围的断层扫描切片（tomographic slice），6.8nm厚。显示细胞核周围的结构，NPC：核孔复合物；MT：微管。
微图案化（micropatterning）已被证明是一个控制体外细胞粘附的有效方法。因此，此技术被广泛用于对细胞形态和细胞内部组织进行标准化。
因为PRIMO的微图案化操作可以在电镜网格的网眼中自动加上排列一致的微图案，PRIMO已成为进行均质化和标准化冷冻电镜（cryo-ET）实验的最佳工具。
进一步而言，在冷冻电镜观察细胞的实验中使用PRIMO进行微图案化，有助于精准地针对特定的细胞内部元素进行成像观察，而用其他成像方法很难做到【2】。
图5. 微图案化可控制细胞的形态和细胞骨架结构【1】：
（a图）：RPE1 LifeAct-GFP细胞内的肌动蛋白微丝组织的活细胞共聚焦显微图像，该细胞生长在PRIMO制造的微图案上（金网眼，SiO2膜R1/4）。黄色箭头：肌动蛋白应力纤维（actin stress fibers）。蓝色箭头：由putative bundles组成的肌动蛋白环（actin rings）。
（h-i图）：一个生长在十字弓形状的微图案（黄色）上的细胞的扫描电镜（SEM）图，微图案由PRIMO制造。黄色长方体表示准备milling的微图案。
P1和P2方块：图6中（j图）和（k图）的断层扫描切片（tomographic slice）的位置。
图6. （j-k图）：冷冻电镜图像：分别是（图5，h图）中P1和P2两个位置的断层扫描切片。
根据十字弓形状的RPE1细胞的肌动蛋白图谱（actin map），在预期的位置发现了大致等同于肌动蛋白横向弧（actin transverse arcs）（与细胞边缘平行但有一定距离）的肌动蛋白束（actin bundles）和在（图5，a图）中显示的内部应力纤维（internal stress fibers）【1】。
因为PRIMO是无掩模和非接触式光刻系统，它可以将您要的微图案用UV光投射到电镜网格的表面，而不会损伤网格的完整性。
图7. 用PRIMO系统对电镜网格进行无掩模的光照图案化（photopatterning）操作【3】：在金电镜网格上加上一层多孔碳膜，在多孔碳膜上包裹一层防污涂层（PLL-g-PEG，聚L赖氨酸-g-聚乙二醇），阻碍蛋白质粘附。加入PLPP光引发剂，通过PRIMO的非接触式、无掩模的光刻技术，用UV光将图案投射到碳膜上，防污涂层被降解，蚀刻出微图案，ECM蛋白可粘附在蚀刻出的微图案上，细胞再粘附在蛋白上。整个过程对电镜网格无损伤。
5.1 PRIMO的原理
法国 Alveole PRIMO “定制化细胞微环境制备系统”是创新性定制细胞模型的工具，能在微米级别的尺度下，以具有超高灵活度和再现性的生物工程手段实现体外微环境的定制，同时可对其机械力学和生化特性进行设计微调。
图8. 上图：选择电脑中任意一张图案，在LEONARDO软件作用下，用PRIMO进行非接触式、无掩模UV投射和蚀刻。PRIMO模块和大多数倒置显微镜兼容。
下图：PRIMO通过控制DMD（Digital Micromirror Device），即 DLP chip的微型镜片的开合状态，控制投射在细胞基质上的UV光的照射强度、照射时间和照射区域，按照图案进行灵活蚀刻【4】。
5.2 PRIMO的主要特点和优势【4】：
• 无掩模：非接触式、无掩模UV投射成像（波长λ=375nm），可灵活控制UV的强度、照射时间、区域；
• 自动化：全自动快速定制，可针对实验条件进行快速优化；
• 高灵活性：可按照任意图案去构建您的基质和/或使其功能化，不限图案的大小和复杂程度，生成不同的细胞模型；
• 基质多样性/兼容性：适用于常规的细胞培养基质，基质可为平面或有微结构，可硬可软，如：玻璃盖玻片、塑料培养皿、聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚苯乙烯、水凝胶（PEG丙烯酸酯、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂、基质胶）、光刻胶，等；
• 常用蛋白：我们的客户日常使用超过10种的各类蛋白：Fibrinogen-488, Fibrinogen-647, Fibronectin, GFP, Neutravidin-488, Neutravidin-647, PLL-PEG-Biotin, Protein A-647, Streptavidin, 初级和次级抗体，等；
• 高分辨率：全视野分辨率为1.2µm（500×300µm ，20倍物镜）；
• 多层次：可蚀刻256个灰阶层次，粘附不同密度层次的蛋白；
• 多种蛋白：可应用3种不同蛋白（根据实验需求）；
• 自动对齐：自动进行检测和图案定位，可自动对齐于微结构或者微图案上；
• 速度快：蚀刻500×300µm图案，20倍物镜，仅需30s。
5.3 PRIMO的应用领域
PRIMO强大的生物建模能力和对细胞微环境的控制，可以为多种生物学实验带来全新的、突破性视角，可用于研究细胞迁移/趋触性、细胞黏附、2D/3D细胞标准化培养、细胞球培养、生物力学、类器官、组织工程、微流体芯片，等多个领域【4】。
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参考文献
【1】M. Toro-Nahuelpan et.al., Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies, Nature Methods, 17, pp.50–54 (2020), https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5
【2】Alveole的官网：
https://www.alveolelab.com/applications/cryo-em-grid-micropatterning/
【3】L. Engel et.al., Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies, Journal of Micromechanics and Microengineering, Volume 29, Number 11 (2019),
https://doi.org/10.1088/1361-6439/ab419a
【4】Alveole的官网：https://www.alveolelab.com/