华东师大田阳教授课题组JACS：单分子荧光寿命探针同时检测线粒体H2O2和ATP并实时成像

H₂O₂是一种稳定的活性氧分子（ROS），是维持线粒体氧化还原过程的主要成分，也是线粒体损伤的信使。同时，ATP是调节线粒体能量代谢的另一个重要信使。值得注意的是H₂O₂和ATP有着密切的关系。线粒体呼吸链产生能量的同时，还产生自由基，自由基迅速转化为H₂O₂。然而，更高的代谢率会导致产生更多H₂O₂，令人惊讶的是，ATP的不足也会导致线粒体膜电位的变化，从而导致H₂O₂的增加。另一方面，过量的H₂O₂可能损伤蛋白质或DNA，从而影响ATP的合成。因此，同时实时监控线粒体H₂O₂和ATP水平的动态变化是十分重要的。基于“打开”或“关闭”策略的荧光成像允许直接和非侵入性的分析，具有较高的空间和时间分辨率。然而，近年来报道的一些成像H₂O₂或ATP的荧光探针用于同时获取H₂O₂或ATP信号存在信号交叉、分布不均匀等问题。

在此，作者开发出利用不同荧光信号同时检测线粒体H₂O₂或ATP水平的单分子双光子荧光寿命探针（TFP）。该探针由三部分组成：线粒体靶向基团、H₂O₂激活基团和ATP激活基团。吡啶阳离子作为线粒体靶向基团，位于探针中部。由于线粒体膜电位为负，所以具有正电荷的探针可以聚集到线粒体。H₂O₂反应基团是萘二甲酰亚胺荧光体衍生物。H₂O₂可以与衍生物的苯硼酸频哪醇（Bb）反应，使得萘二甲酰亚胺恢复荧光。ATP反应基团是二亚乙基三胺修饰的罗丹明衍生物。该衍生物具有多个氨基，很容易捕获ATP。因为ATP的磷酸基团可以和氨基形成氢键，使得螺环内酰胺被打开，最终产生荧光。

为了验证所开发的TFP探针可以通过构象变化选择性地响应H₂O₂，作者首先研究了TFP对H₂O₂的光学变化。H₂O₂的荧光通道激发波长为710 nm，发射波长为430-530 nm。在H₂O₂存在的情况下，紫外吸收发生蓝移，从401 nm蓝移到380 nm。荧光随着H₂O₂浓度的增加而增强。对平均荧光寿命的分析显示，探针为双光子发光。随后，作者又单独分析了TFP对ATP响应的光学性质。ATP的荧光通道激发波长也为710 nm，但其发射波长为550-650 nm。在ATP存在的情况下，562 nm出现新的紫外吸收峰，荧光随着ATP浓度增加而增强且呈线性关系，平均荧光寿命计算表明这也是一个双光子发光过程。最后，作者研究了在H₂O₂和ATP同时存在的情况下，TFP的发光情况。结果显示，随着浓度的增加，二者的双光子荧光强度和平均荧光寿命都逐渐提高。以上这些结果表明，TFP可以同时的无交叉检测H₂O₂和ATP。

图3. H₂O₂和ATP存在下，探针光学性质（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

鉴于TFP优秀的光学性质，作者研究了该探针用于同时检测神经细胞内H₂O₂和ATP，并且实现双光子寿命成像。荧光信号共定位分析显示，探针TFP很容易进入线粒体并且在线粒体内可以稳定存在2 h。成像结果显示，不同浓度的外源性H₂O₂存在下，H₂O₂和ATP荧光信号剧烈变化。通过计算发现，ATP水平降低。随后，作者用线粒体呼吸链抑制剂研究了能量系统对氧化还原的影响。结果表明，ATP急剧下降，但H₂O₂明显增加。这表明线粒体内ATP合成被阻断影响氧化还原平衡，从而影响H₂O₂水平。

受探针TFP的高选择性和准确性的鼓舞，作者尝试用该探针实时、定量的监测自由基O₂^•–导致的线粒体H₂O₂和ATP的变化。实验结果表明，H₂O₂水平和ATP水平确实被O₂^•–影响，探针TFP可以通过双通道成像捕捉到这些变化。

为了检验TFP探针在体内的性能，作者进一步将TFP应用于活体斑马鱼幼体的成像。利用TFP，分别对正常氧和乏氧斑马鱼进行研究。成像结果显示，H₂O₂和ATP成像深度为50-400 μm，具有很强穿透性。缺氧斑马鱼的存活率较常氧斑马鱼明显下降。这表明斑马鱼在低氧条件下经历了氧化损伤和能量透支。 

图6. 乏氧和正常氧条件下斑马鱼成像（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结：华东师范大学田阳教授课题组开发了一种双光子荧光寿命探探针，该探针可以实时成像并同时检测线粒体H₂O₂和ATP的变化而不发生信号串扰，因为TFP的荧光寿命在0.4-10 μM H₂O₂和0.5-15 mM ATP的检测范围内表现出良好的响应和选择性，具有荧光寿命成像的准确性和定量能力的优点，具有两种不同的发射光谱。利用该探针，田阳教授课题组研究了线粒体H₂O₂和ATP的动态变化及其关系，首次揭示了超氧阴离子对H₂O₂和ATP水平的影响，为多物种成像提共了一种通用设计方法。

撰稿人：犟子柳