2020年度加拿大Gairdner基金会将生物医学奖授予了Roel Nusse教授，他在Wnt signaling领域的奠基性工作帮助学界在发育生物学、癌症和干细胞研究获得了深入理解和长足发展。Wnt这个名字来源于果蝇基因突变表型Wingless和乳腺癌MMTV反转录病毒插入int-1基因位点。毫不讳言，Nusse教授系列工作为整个领域插上了翱翔的翅膀。近日，Cell 杂志Leading Edge专栏由来自Nusse教授有深厚渊源的荷兰阿姆斯特丹大学的Amerongen教授系统介绍了Nusse教授发现Wnt的系列历程。![]()
Roel Nusse（1950—），斯坦福大学教授、HHMI研究员、美国国家科学院院士、细胞信号转导与干细胞领域的先驱者，1982年发现Wnt基因，HHMI研究员。图片引自：https://med.stanford.edu/news/all-news/2016/12/roeland-nusse-wins-breakthrough-prize.html多细胞生物面临非常繁重的任务，将细胞拼装组织成繁复各异的组织。它们不仅需要在胚胎发育阶段发展功能形态多样的组织，在成体阶段还需要有效地维持组织稳态平衡。组织器官处于动态更新循环中；而细胞增殖和分化的失衡会造成机体众多疾病：不受控制的细胞增殖是肿瘤形成的基础；组织系统失调常常是神经退休性疾病和衰老的特征。在过去40年中，Wnt信号传导通路作为细胞间交流重要的手段，在众多生物学过程有重要作用。它在多细胞生物中广泛保守，是胚胎发育模式形成必不可少的调控机制。Wnt不仅影响发育生物学和进化生物学；在生物医学领域也有深远影响。而Roel Nusse教授在Wnt众多领域都有重要贡献，引领了它的发展。Nusse与Wnt的偶然结缘在1970年代，当时他还是荷兰癌症研究中心的一名研究生。他在研究一种乳腺癌肿瘤病毒MMTV，这是一种反转录病毒，科学家很早就知道它能引起不同品系老鼠的乳腺癌，但机制未知。而荷兰癌症研究中心早在1930年代开始就围绕MMTV开展众多研究，Nusse的课题是其中之一。1970年代，重组DNA技术开始崭露头角。DNA克隆可以将来自不同物种的DNA分子粘合拼接在一起。科学家意识到这种技术有一定危险性，在著名的Asilomar会议上还讨论了实验指导条例。彼时，多数科学家尚未能接触DNA分子；更遑论对DNA进行实际操作。同时，关于什么造成了肿瘤癌症发生也是一个热烈讨论的问题。当时顶尖研究已知道快速转化Rous肉瘤病毒携带有致癌基因，是后来被发现的v-src基因。而其它的慢转化病毒，比如MMTV则没有发现具体致癌基因。其后，Harold Varmus和J. Michael Bishop的诺奖工作（1989年的诺贝尔生理学或医学奖）揭示了v-src基因在细胞中有同源位点：c-src，病毒对原癌基因的调控是肿瘤发生的关键。原癌基因c-src在多个物种中被发现，这提示癌症起源于正常细胞变异，那么MMTV是否是通过激活这些原癌基因来诱发肿瘤呢？Roel Nusse一开始集中研究精力在MMTV感染机制和它的一些蛋白的性质上。1980年开始，研究者有机会接触到重组DNA技术，以期能揭开MMTV整合进乳腺上皮细胞带来的改变。当时，Nusse和Harold Varmus开始联系，后者亦同样对MMTV致癌之谜非常感兴趣。Nusse来到Varmus在加州大学旧金山分校的实验室进行博士后研究。在正式接受信件中描绘了一系列有趣的课题，其中提及一项今后将成为开创性工作的研究-直接在肿瘤DNA中寻找那些重要“显性”的原病毒基因。在Nusse的个人陈述中也提到这项工作，而这封正式接受信被美国医学图书馆收藏保存。Nusse和Varmus开始寻找MMTV在肿瘤组织的整合位点。在这个特殊的整合位点(int-1)上，病毒插入了未知基因附近，通过病毒LTR的超强调控元件改变未知基因的表达。同时还有许多其它肿瘤组织也有病毒整合在int-1位点附近，进一步提示int-1位点变异可造成乳腺肿瘤。一年后，int-1位点基因被克隆。int-1基因序列与已知任何致癌基因没有同源性，这是一个全新的致癌基因【1】，相关工作于1982年发表在Cell杂志上。完成博士后研究后，Nusse回到荷兰癌症研究院。在这里他和同事努力想要找到int-1基因的功能和致癌机理，但早期工作收效甚微。尽管重组DNA技术得到广泛应用，当时并没有得到很多基因序列，UCSD数据库中只有约2000个基因序列信息。因此，没有发现 int-1基因与任何已知基因同源，只发现其N端为疏水结构域—这是Wnt蛋白的分泌信号。制备int-1基因蛋白抗体的工作也并不顺利。int-1基因转录本可见在胚胎发育阶段表达，而没有发现其在成体阶段表达。通过和Anton Berns合作，他们还开发了int-1转基因小鼠。转基因小鼠不能成活，因此也未能研究成体阶段肿瘤生成。因为int-1基因集中在胚胎阶段表达，并在物种间高度保守。1986年开始，Nusse试图克隆int-1在果蝇中的同源基因，以着手研究筛选有发育缺陷的基因突变。幸运的是，他们成功地定位了基因位点，正是体节极性基因wingless（wg）。int-1基因成为了首个已知的哺乳动物致癌基因在生物正常发育中也有重要作用，可造成果蝇发育缺陷【2】，相关工作于1987年发表在Cell杂志上。随着同源基因克隆，而果蝇遗传研究工具多样突变众多，Nusse得以开启了全新研究局面。制备wg蛋白抗体的工作也非常顺利。早期研究发现，它影响作用于非自主细胞；其序列进一步提示wg是分泌性蛋白。通过和剑桥大学Peter Lawrence合作，他们找到了wg在幼虫行使功能的具体区域。电镜研究发现，wg蛋白信号位于胞质和胞外的囊泡中，在产生它和engrailed表达可接受wg信号的细胞中都可找到。Nusse在文章中总结到：wingless蛋白可被旁分泌，影响附近细胞【3】。1989年，Roel Nusse来到斯坦福大学，加入新成立的Beckman分子遗传医学中心发育生物学系。团队还构建了wg转基因品系，过表达wg同样产生了胚胎发育表型。这样，他们可利用此表型筛选抑制子，找到调控wingless的上下游基因。当时多个研究组采用了类似的筛选策略，充分利用了果蝇强大遗传学工具。早在1980年代初期，德国科学家Christiane Nüsslein-Volhard和Eric Wieschaus分离鉴定了果蝇中的系列体节发育基因，这是又一项诺奖工作。wingless属于其中的体节极性基因类别。Mark Peifer 和 Eric Wieschaus随后找到另一个作用于wg的基因armadillo（arm）--arm同样可影响果蝇模式发育和果蝇成体。结合突变克隆和遗传上位实验，Nusse, Peifer, Perrimon和Wieschaus实验室发现了wg通路众多基因，并决定它们先后作用的顺序。至此，他们的工作完整的展示了Wnt信号通路的核心机制。在领域得到拓宽发展的时候，有远见的科学家开始讨论对int-1/wingless相关蛋白新的命名系统规则。Andrew McMahon和Randall Moon也参与到命名规则制定讨论中，他们在老鼠和爪蟾中鉴定了很多int-1相关基因，著名的爪蟾前后轴决定发育实验揭示了int-1在脊柱动物早期发育阶段的功能。“Wnt（wint）”这个名字来指定具有wingless表型有MMTV整合位点的基因家族。Wnt名字来源的另一个传说是Roel Nusse的妻子Betsy建议。尽管找到了大部分Wnt通路的基因，仍然有两个重要的问题还没有得到回答。细胞表面响应结合Wnt信号的受体还不知道；另一个问题是信号传递到Armadillo后，下游是什么。果蝇系统研究再次为这两个问题提供了部分答案。Nusse和Jeremy Nathans合作研究找到frizzled 2是wg的受体之一。而关于Armadillo下游的问题则被另一位科学家找到了答案，这也是Wnt 领域少数几个没有来自Nusse的重要工作。脊柱动物中beta-catenin（CTNNB1）是果蝇armadillo的同源基因，有粘连蛋白功能。在Nusse克隆fz2的时候，来自Hans Clever和其他几个欧洲实验室的工作表明CTNNB1可以和下游转录因子TCF/LEF家族蛋白相互作用。Hans Clever当时研究TCF1这个基因，TCF1是T细胞发育中重要的转录因子。Walter Birchmeier研究则集中在E-cadherin，发现它可以和CTNNB1结合，抑制肿瘤浸润和转移。酵母双杂交实验证实了CTNNB1可以和TCF1、LEF1结合。这些实验结果说明了Wnt信号通路可以调节下游目的基因的转录；同时酵母双杂实验被演变发展成了检测Wnt信号通路活性的重要实验—著名的TOPFLASH实验：Luciferase基因上游被插入数个串联的TCF/LEF结合位点，通过测量Luciferase荧光强度来反映Wnt信号通路的激活状态。Paul Polakis和其他人还发现CTNNB1可以和著名的抑癌蛋白APC相互作用，进一步提示Wnt信号通路和癌症之间有不可分割的联系。在1998年，科学家整合遗传生化实验的证据建立了Wnt信号通路的工作原理（经典Wnt信号通路）：在未有Wnt信号时，通过降解复合物来降解CTNNB1蛋白；而Wnt信号胞内传递则抑制了降解复合物的活性，CTNNB1蛋白可入核和TCF1/LEF1蛋白结合，激活下游基因的转录。Nusse，Wnt signaling来到干细胞研究与此同时，Nusse转而重新着手解决Wnt蛋白的纯化问题。早在1988年，他们就试图表达纯化活性Wnt1蛋白，但没有成功。在2003年，Karl Willert和Roel Nusse成功地得到了活性小鼠WNT3A蛋白。成功的诀窍是细胞培养基中加入血清蛋白，并利用去垢剂在分离纯化步骤中保持Wnt蛋白的可溶性。没有去垢剂，Wnt蛋白则会因为翻译后的脂化修饰变得疏水难溶，失去活性【4】。这一重要的工作成果开启了Nusse研究新的一页，他逐渐从果蝇系统转移到哺乳动物组织的研究。Wnt/CTNNB1信号通路不仅对生物机体发育非常重要，他们也逐步发现Wnt可参与维持组织稳态平衡，这意味着它可能调控干细胞。2010年，Nusse实验室工作展示了WNT3A蛋白可调节包括胚胎干细胞在内的多种干细胞自我更新。Nusse的研究工作回到了最初开始的地方，研究乳腺上皮干细胞。Roel Nusse最近的工作是利用在细胞示踪技术，在多个组织中包括肝和血管内皮找到了Wnt调控的干细胞组群【5】，相关工作发表在Cell Stem Cell杂志上，第一作者曾艺博士现为中科院上海生化细胞所研究员（Cell突破！曾艺组首次鉴定小鼠胰岛成体干细胞，建立胰岛类器官体外长期扩增培养体系）。![]()
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Roel Nusse当之无愧地获得本年度Gairdner奖，他的工作带来了很多重大突破，横跨癌症和干细胞等多个领域。在Nusse和Varmus最初的MMTV筛选之后，利用反转录病毒插入进行突变筛选，数十年来找到了很多致癌基因。多个模式生物的研究揭示了Wnt在组织再生中有重要的调控作用。被评为2017年度技术的类器官培养就应用了干细胞基础研究成果，给再生医学带来了很多希望。成体干细胞的长期培养无一例外地需要Wnt/CTNNB1加入。因为Wnt信号通路拥有很多重要功能，多种靶向Wnt通路的药物在开发之中。Wnt抑制剂以阻断肿瘤中的异常信号传递；而Wnt激活剂可调动干细胞以帮助组织再生和损伤修复。正常Wnt1基因的高表达可造成乳腺肿瘤则改变了我们的认识，不仅仅是基因突变，而改变基因的mRNA和蛋白水平也可造成癌症。科学家意识到正常的发育调节通路可被肿瘤细胞劫持来维持它的生长分化。阻断Wnt信号分泌的抑制剂，以及干扰WNT/FZD结合的抗体的开发都很成功。临床应用的难点主要在于治疗的同时能保证Wnt正常生理功能。WNT/CTNNB1只是Wnt信号通路的一部分，另一部分Wnt信号通路不依赖于CTNNB1传递--非经典Wnt信号通路。非经典Wnt通路调控了包括Planar Cell Polarity，Convergent extension等多个复杂的细胞系统迁移，并可影响癌细胞发生发展。新一代科学家将在这一领域继续探索研究。Roel Nusse更愿意介绍他的研究是干细胞而非局限于Wnt。但是毫无疑问，Nusse是整个Wnt研究领域的传奇。他也是一个大家长：每个Wnt相关重要会议都由Nusse来结束，他拿着话筒感谢会议组织者，总结会议亮点，指出关键问题。20年来，Nusse还坚持不懈地更新维持Wnt主页（(http://wnt.stanford.edu )。每一个新进入Wnt的研究者都收益于此。网站汇聚了很多实验室的未能发表的负结果，还有实验窍门比如纯化的Wnt蛋白可能的陷阱。自1990年开始，Nusse一直是HHMI的研究员，接受其资助。2020年，Nusse将庆祝他70周岁的生日，他仍然致力于探究组织发育和维持的基础原理。希望他的70世代将开启更多更美好的探索。值得一提的是，Nusse还曾获得300万美金的“生命科学突破奖”。图片引自：https://www.zimbio.com/photos/Roel+Nusse/2018+Breakthrough+Prize+Red+Carpet/LhKbfSBcGIO
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.03.0331. Nusse, R., and Varmus, H.E. (1982). Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell 31, 99–109.2. Rijsewijk, F., Schuermann, M., Wagenaar, E., Parren, P., Weigel, D., and Nusse, R. (1987). The Drosophila homolog of the mousemammary oncogene int-1 is identical to the segment polarity gene wingless. Cell 50, 649–657.3. van den Heuvel, M., Nusse, R., Johnston, P., and Lawrence, P.A. (1989). Distribution of the wingless gene product in Drosophila embryos: a protein involved in cell-cell communication. Cell 59, 739–749.4. Willert, K., Brown, J.D., Danenberg, E., Duncan, A.W., Weissman, I.L., Reya, T., Yates, J.R., 3rd, and Nusse, R. (2003). Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. Nature 423, 448–452.5. Zeng, Y.A., and Nusse, R. (2010). Wnt proteins are self-renewal factors for mammary stem cells and promote their long-term expansion in culture. Cell Stem Cell 6, 568–577.