JOL论文推荐 | cAMP信号通路参与调节缺氮培养条件下莱茵衣藻细胞内油脂的生物合成

JOL海洋湖沼学报

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莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种单细胞绿藻，作为一种经典的模式生物，它被广泛用于生物过程的研究(如光合作用、鞭毛运动和油脂代谢等)。同时，由于莱茵衣藻细胞核、线粒体和叶绿体的基因组已被全部测序并且其遗传操作技术成熟，筛选标记和诱导表达载体丰富，它在快速筛选和鉴定特异突变体的应用中也具有强大优势。

大量研究表明，在压力胁迫下(如缺氮、高光照等)，许多微藻会积累大量油脂，这些油脂以脂滴(Lipid droplets, LDs)的形式存在。随着科研人员对脂滴生理功能研究的深入，大量能影响脂滴形成、降解和稳定性的蛋白得以被发现。此外，一些对环境敏感的分子和基因也会影响藻类和高等植物中脂类的代谢。虽然针对与环境胁迫和脂类代谢有关的基因已经有一些研究报道，但是对微藻在压力条件下积累油脂的分子机制还不清楚。

针对这一问题，中国科学院水生生物研究所黄开耀研究员团队建立了一个莱茵衣藻突变体库，希望通过筛选到的若干株油脂含量减少的突变体发现一些参与环境胁迫下脂类代谢调节的基因。研究论文“Cyclic adenosine monophosphate signal pathway is involved in regulation of triacylglycerol biosynthesis following nitrogen deprivation in Chlamydomonas reinhardtii”发表在Journal of Oceanology and Limnology 2020年第2期，文章第一作者为缪荣丽博士。

实验结果

作者通过把巴罗霉素耐药基因aphVIII转录入莱茵衣藻的基因组建立了一个突变体库，并从两株莱茵衣藻油脂减少突变体M2和M6中筛选出两个突变基因。通过检测缺氮胁迫36h内突变株的相对荧光强度(F_NR/F_Chl)准确反映细胞内的油脂含量变化，发现油脂含量随突变基因表达水平的下调而相应减少。随后作者对突变基因编码蛋白的结构域进行了分析，发现二者分别含有一个保守的环状单核苷酸磷酸(cyclic mononucleotide phosphate, cNMP)结合蛋白和一个腺苷酸的蛋白结构域，均为环状磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信号通路的重要组成原件，因此推测突变基因可能通过cAMP信号通路参与调节莱茵衣藻细胞内油脂的生物合成。该研究结果对于解析微藻油脂代谢机制具有重要意义。

图1 筛选油脂合成缺陷型的莱茵衣藻突变体

注：a. 筛选突变体的技术路线；b. 使用定量薄层层析(Thin layer chromatography, TLC)对缺氮培养2天后的突变体的油脂含量进行测定，进一步确认油脂合成缺陷型突变体，其中M1~M13为油脂合成减少的突变体，黑色三角形指示的L1~L3为致死突变体。

图2 使用尼罗红(Nile Red)对亲本藻株CC4348和两株突变体M2、M6进行染色，对其油脂含量变化进行荧光分析

注：a. 使用共聚焦显微镜观察和比较3株藻细胞内油滴数目和大小随着缺氮时间的变化；b. 对缺氮1天的藻细胞内的油滴进行计数，采用单因素方差分析对差异的显著性进行分析，***表示P<0.001；c. 使用酶标仪检测缺氮2天内不同时间点的中性脂的相对荧光强度。

图3 分别使用薄层层析和气相色谱-质谱(Gas chromatography–mass spectrometry, GC-MS)联用法对缺氮2天内的亲本藻株CC4348和突变体M2、M6的油脂表型进行检测

注：a~b. 取8×10⁸个藻细胞提取油脂，进行TLC分析，比较亲本藻株CC4348和突变体M2、M6的TAG 含量；c. 使用Image-J软件对a图和b图中的TAG含量进行半定量分析；d. 使用GC-MS对缺氮过程中各藻株中油脂组成成分进行分析；c、d 中的差异显著性分析均使用单因素方差分析；ns表示没有显著性差异；*表示P<0.05, **表示P<0.01, ***表示P<0.001；以上结果表明，荧光、TLC和GC-MS等不同检测方式均显示突变体M2和M6细胞内油脂含量较亲本藻株CC4348明显减少。

图4 对突变体M2和M6的突变基因进行克隆和鉴定

注：a~b. 使用限制内切酶定向PCR分别克隆M2和M6的突变基因，将大于750bp的条带切胶送测序；c. 测序结果显示，M2和M6的突变基因在莱茵衣藻基因组位置相邻，均位于6号染色体上，分别定位于Cre06.g278111 (KCN11) 基因的第一个外显子上和Cre06.g278110 (ACYC3) 基因的3’UTR上(基因信息来源于Phytozome v12.1, Chlamydomonas genome), 其中黑色框为外显子, 白色框为非编码区(UTR)；d. 突变基因在衣藻中编码的蛋白KCN11(钾离子通道蛋白)和ACYC3与四种高等植物中的KCN11同源蛋白的蛋白结构域示意图(其中蓝色框为cNMP结合结构域，黄色框为腺苷酸结构域)，使用Prosite对蛋白基序进行扫描(https://prosite.expasy.org/)，其中Cr代表C.reinhardtii，At代表Arabidopsis thaliana，Os代表Oryza sativa，Zm代表Zea mays，Rc代表Ricinus communis；e. 将图c5个物种中的蓝色框显示的cNMP结构域序列进行比对，cNMP结构域显示出高度保守性，红色表示氨基酸残基相似性高，蓝色表示氨基酸残基相似性低，所有的蛋白序列均下载自phytozome v12.1 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)；f~g. 使用荧光定量PCR分别对M2和M6中的突变基因(KCN11)和(ACYC3) 的mRNA表达丰度进行检测，显示二者表达丰度均较亲本藻株中对应基因表达丰度显著下降，使用T检验对差异显著性进行分析，***表示P<0.001。

END

Citation:

MIAO Rongli, HUANG Kaiyao. 2020. Cyclicadenosine monophosphate signal pathway is involved in regulation of triacylglycerol biosynthesis following nitrogen deprivation in Chlamydomonas reinhardtii. Journal of Oceanology and Limnology, 38(2): 517-528. https://doi.org/10.1007/s00343-019-8345-0