【催化】ACS Catal.：改造P450氧化酶实现对氧化程度以及区域选择性的控制

P450氧化酶具有选择性活化碳氢键并将其氧化为羟基以及羧基的能力，通常情况下仅对天然的底物具有很好的催化活性以及高的区域和立体选择性，这些酶在天然产物的生物合成中起着很重要的作用。然而，植物P450酶由于重组之后不易于表达和纯化，使得其在应用方面面临较大挑战。近日，北京理工大学和清华大学李春、北京理工大学于洋、北京理工大学王颖课题组针对glycyrrhetinic acid 的生物合成，通过实验结合计算模拟的方法对P450氧化酶CYP72A6进行改造，分别得到了醇、醛、羧酸为主产物，以及其中一种异构体。相关研究成果发表在ACS Catal.上（DOI: 10.1021/acscatal.0c00128）。

首先，作者将合成11-oxo-β-amyrin的基因以及CYP72A6重组在宿主（SynV）中表达得到 C-30位氧化程度不同的产物以及C-29位氧化的羧酸（Figure 1A）。作者以化合物11-oxo-β-amyrin为底物，通过同源模型以及分子对接实验发现野生型的CYP72A6中，C-30位比C-29位距离亚铁中心更近（Figure 1B），距离都在能够催化的范围之类，这跟实验得到的结果一致。

Figure 1. (A) GC−MS spectrum showing the product distribution harboring wild type CYP72A63; (B) Structure model showing 11-oxo-β-amyrin in wild type CYP72A63; (C) Structure model showing glycyrrhetol in the wild type CYP72A6 .

（来源： ACS Catal.）

然而，当使用醇为底物进行计算模拟时，作者发现由于C-30的区域与T338 之间的疏水相互作用，使得C-30的区域远离亚铁中心（Figure 1C）。作者通过计算模拟的结果，挑选了活性口袋里面可能影响疏水作用的氨基酸（L330, L333, T338和A334）进行突变，最终筛选出CYP72A63（T338S），得到产率94.2% 的C-30位氧化为酸的产物以及5.8% 的醛（Figure 2C）。同样的，作者使用计算模拟的方法对CYP72A63（T338S）催化的选择性进行研究，发现11-oxo-β-amyrin在模型中发生了一些偏转，使得C-30位与C-29位同亚铁中心的距离差更大，两个碳原子与亚铁中心形成的夹角更小（Figure 2A）。而以醇为底物进行模拟可以发现，C-30位处于适宜的角度和距离，以便于底物进一步氧化为酸。

Figure 2. (A) Structure model of CYP72A63(T338S) with 11-oxo-β- amyrin; (B) Structure model of CYP72A63 (T338S) with glycyrrhetol; (C) GC−MS spectrum showing the product distribution in yeast strain harboring CYP72A63 (T338S).

（来源： ACS Catal.）

随后，作者开始研究如何将主产物停留在醇，作者设想远离活性口袋的氨基酸可能参与底物的识别和结合，对其进行突变可能会影响醇与酶之间的结合，从而影响进一步的氧化过程。同样的，基于计算模拟，作者挑选了L509, L137和L242进行突变，尽管L509H/L509N得到更大比例的醇，但最终的滴度却很小，可能是其亲水的侧链干扰了底物的结合。最终L509I得到了最好的结果（Figure 3B，Table 1）。

Figure 3. (A) L509 locates in the distal active pocket; (B) GC−MS spectrum showing the product distribution in yeast strain harboring CYP72A63 (L509I).

（来源： ACS Catal.）

之后，作者设想可以通过调节不同的P450还原酶来影响电子传递以及底物结合的过程，从而得到以醛为主产物。通过实验筛选，作者发现CYP72A63（T338S） 与GuCPR2的组合得到最好的结果，以及31.4±5.8 mg/L的滴度。（Figure 4， Table 2）。同时，这也是目前为止P450氧化高选择性地得到醛的第一个例子。

Figure 4. GC−MS spectrum showing the product distribution in yeast strain harboring CYP72A63 (T338S) and GuCPR2.

（来源： ACS Catal.）

基于以上的结果，作者认为，如果底物与酶活性口袋结合的方式做一些调整，使得C-29 能够朝向亚铁中心，便有可能得到C-29位氧化的产物。作者预测位于E环两侧的L398和L149可能会对底物实现一定程度的转动起作用，为了验证这一设想，作者进行这两个位置的定点饱和突变，发现L398I可以得到产率100% C-29位氧化的羧酸（Figure 5C）。为了弄清楚高区域选择性的机制，作者基于这一突变进行了计算模拟，发现底物发生了接近180度的旋转，使得C-29更加的接近亚铁中心（Figure 5B）。

Figure 5. (A) Substrate pose in wild type CYP72A63; (B) Substrate pose in mutant CYP72A63(L398I); (C) GC−MS spectrum showing the product distribution in yeast strain harboring CYP72A63 (L398I).

（来源： ACS Catal.）

最后，作者通过调整质子传递过程，进一步提高了催化的效率。首先，作者通过计算模拟，将分子氧添加到模型当中，发现野生型的CYP72A63 中338位的苏氨酸中的羟基指向远离分子氧的方向（Figure 6A），而突变体T338S中丝氨酸中的羟基指向活性中心（Figure 6B）。这一差异使得醇跟氧之间进行质子传递时的效率产生差别，从而影响了催化活性。作者通过模型推测K236, E337和S338 可能涉及这一过程（Figure 6C），另一方面，将这些氨基酸突变为丙氨酸时，催化活性丧失，也证实了这几个氨基酸在质子传递过程中是必要的。通过研究这几个氨基酸周围的氨基酸，作者发现W205 可能会妨碍K236构象的变化，从而影响到催化活性，于是对其进行了突变，当将其突变为丙氨酸时，由于解除了对K236的约束，最终CYP72A63（T338S/W205A） 提高了21.3% 的产率，滴度达到了36.4±3.0 mg/L。基于同样的策略，醛和醇的产率也分别提高了59.6%和8.2%（Figure 6D）。

Figure 6. (A) Binding pattern of 11-oxo-β-amyrin in wild type CYP72A63 with heme bonded oxygen molecule; (B) Binding pattern of 11-oxo-β-amyrin in CYP72A63 (T338S) with heme- bonded oxygen molecule; (C) Proton transfer pathway; (D) Increase rate of rare triterpenoids through strengthening proton delivery by mutant W205A. 

（来源： ACS Catal.）

总之，作者通过计算模拟结合定向进化，巧妙地控制了底物的氧化程度以及区域选择性，其中包括：（1）通过调节酶空腔与底物的可亲性，以及底物在空腔中的朝向得到主产物为羧酸；（2）通过减弱醇与底物的可亲性，使其不能接着被氧化；（3）调节合适的P450还原酶得到主产物为醛；（4）突变关键残基使底物旋转，从而得到异构体；（5）通过优化质子传递系统从而提高产率。基于此，作者的研究为其他P450氧化酶的改造提供了很好的借鉴意义。