俞书宏/罗忠Science Advances：仿生纳米药物诱导肿瘤细胞靶向铁死亡
第一作者：薛臣成，李孟桓，赵阳
通讯作者：俞书宏，罗忠
通讯作者单位：中国科学技术大学，重庆大学
研究亮点：
1. 报道了一种基于原位矿化组装的无定形碳酸钙基Fe2+-阿霉素复合配合物，用于肿瘤靶向化学凋亡与铁死亡诱导。
2. 该纳米制剂具有较强的铁死亡作用，具有一定的临床应用前景。
肿瘤细胞铁死亡
铁死亡（Ferroptosis）是一种与传统细胞凋亡（Apoptosis）、细胞坏死（Necrosis）及其他已知细胞死亡信号通路明显不同的细胞死亡信号通路。最近的研究表明，铁死亡在肿瘤的发生和发展进程中扮演着重要作用，有望发展成为一种新的癌症治疗策略。然而，如何针对肿瘤细胞实施特异性靶向铁死亡诱导仍然是一项需迫切解决的关键科学难题。
成果简介
最近，中国科学技术大学俞书宏院士团队和重庆大学罗忠教授课题组发现原位矿化组装的碳酸钙基Fe2+-阿霉素复合配合物可协同诱导肿瘤细胞铁死亡和凋亡的现象。
俞书宏院士团队基于在钙基仿生生物材料的多年研究积累(Science 2016, 354, 107-110；Angew. Chem.Int. Ed. 2015, 54, 919；Small 2010, 6, 2436；Adv. Mater. 2005, 17, 1461等前期工作)与重庆大学罗忠教授紧密合作，构筑出生物可降解的肿瘤微环境响应性生物靶向含铁碳酸钙药物组装体，发现其能协同诱导肿瘤细胞铁死亡和化学凋亡（图1所示），展现出良好的临床应用前景。
图1. 无定形碳酸钙纳米制剂铁死亡/化疗协同诱导肿瘤细胞死亡的分子机制。
要点1：原位矿化组装单分散的无定形含铁碳酸钙纳米药物组装体
在该项研究中，研究人员首先通过控制环境介质二氧化碳浓度和pH值，调控钙离子、二价铁离子和阿霉素（DOX）在乙醇中的化学配位，原位矿化组装成单分散的无定形含铁碳酸钙纳米药物组装体（图2所示）。含铁无定形碳酸钙药物组装体能在肿瘤细胞环境下自降解为钙离子、二氧化碳、二价铁离子和药物分子。含铁碳酸钙复合组装体在矿化组装过程中，不引入外界其他物质，反应条件简单，能根据个体需求实施药物和钙/铁离子的精细调控和协同组合。含铁碳酸钙药物组装体的表面分级修饰PEG和叶酸分子，既提高血液循环时间并避免被免疫系统（单核吞噬细胞）识别摄入或与蛋白质发生作用，又能保护复合组装体表面的靶向分子（叶酸）不会和体内生物分子或正常细胞发生接触。复合组装体通过EPR效应而递送至肿瘤组织，微环境的MMP-2酶促使PEG从复合组装体表面解离，暴露出叶酸分子而特异性识别肿瘤细胞，提高吞噬效率。
图2. 肿瘤微环境响应性生物靶向含铁碳酸钙药物组装体的构筑及物理化学特性。
要点2：含铁碳酸钙药物组装体的药物释放及降解行为
含铁碳酸钙-阿霉素组装体（ACC@DOX.Fe2+-CaSi-PAMAM-FA/mPEG）的抗肿瘤效应依赖于组装体中DOX和Fe2+的释放及其与肿瘤细胞内细胞器的相互作用。因此，研究人员考察了含铁碳酸钙-阿霉素组装体在模拟体液中的释放动力学行为（图3）。
研究发现，无定形碳酸钙载体在中性环境中，也极易水解，但是本研究中开发出的CaSi外壳包覆方法能显著增强其稳定性。如图3所示，所构筑的含铁碳酸钙-阿霉素组装体置于生理环境下(pH=7.4)，孵育36小时后DOX的释放量仍然低于15％，证明其具有优异的稳定性。然而，含铁碳酸钙-阿霉素组装体置于类溶酶体的酸性环境下（pH=5.5），孵育36小时后DOX的释放量达到70％，证实具有较好的酸性响应性。电感耦合等离子体（ICP）证实Fe2+离子的释放行为与DOX的释放特性基本一致。透射电镜（TEM）结果进一步证实含铁碳酸钙-阿霉素组装体置于酸性环境中，24小时就可以较好的降解并呈现中空结构（图3 C所示）。含铁碳酸钙-阿霉素组装体释放的DOX-Fe2+配合物的颜色逐渐从深紫色变为橙色，DOX的特征荧光量也明显增加（图2B所示）。DOX和Fe2+之间的络合物能终止DOX的荧光效应，颜色变化和荧光恢复证实DOX-Fe2+复合物已经解离并还原为游离形式。DOX-Fe2+复合物的解离是由于DOX酸性条件下的苯酚质子化，能降低DOX化疗的心脏毒性。
图3. 含铁碳酸钙药物组装体的药物释放及降解行为。
要点3：含铁碳酸钙-阿霉素组装体与肿瘤细胞的相互作用及诱导胞内脂质过氧化物的生物学效应
他们还研究了含铁碳酸钙-阿霉素组装体与肿瘤细胞的相互作用及诱导肿瘤细胞产生的脂质过氧化物的生物学效应。研究发现，ACC@DOX.Fe2+-CaSi-PAMAM-FA/mPEG被金属基质蛋白酶2（MMP-2，肿瘤组织过表达）体外刺激后，能够暴露出叶酸分子而特异性的被肿瘤细胞所吞噬。共聚焦显微镜荧光分析和肿瘤细胞内ICP铁离子测定均证实， ACC@DOX.Fe2+-CaSi-PAMAM-FA/mPEG被4T1乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞吞噬的效率远远高于正常细胞（图4 A, C）。含铁碳酸钙-阿霉素组装体表面修饰的树状大分子赋予该组装体具有非常强的正电荷，促使该组装体能通过海绵效应而逃离并破坏溶酶体（图4,B），进入细胞胞质内。生物降解出来的阿霉素和铁离子相互作用，细胞流式（图4,D）和共聚焦显微镜（图4,E）证实其能协同高效诱导肿瘤细胞内脂质过氧化物的产生，进而破坏线粒体的膜电位（图4F）而诱导肿瘤细胞的凋亡。
图4. 含铁碳酸钙药物组装体与细胞的相互作用及诱导胞内脂质过氧化物的效应。
要点4：考察含铁碳酸钙-阿霉素组装体诱导肿瘤细胞死亡的生物学效应及其分子机制
为了深入考察含铁碳酸钙-阿霉素组装体诱导肿瘤细胞死亡的生物学效应及其分子机制，研究人员通过细胞流式、共聚焦、细胞活测定、特异性蛋白表达和DNA ladder等生物学实验验证其体外疗效。
研究发现，ACC@DOX.Fe2+-CaSi-PAMAM-FA/mPEG被金属基质蛋白酶2（MMP-2，肿瘤组织过表达）刺激后，能够更加有效的诱导细胞死亡。细胞流式分析、共聚焦显微镜和光学显微镜结果表明ACC@DOX.Fe2+-CaSi-PAMAM-FA/mPEG诱导 4T1乳腺癌细胞和黑色素瘤细胞死亡的效率远远高于其他实验室对照组（图5 A,B,C，VI实验组&其实实验组），红色代表细胞死亡，绿色是活细胞。随后，通过蛋白质电泳和DNA ladder等发现阿霉素不仅能嵌入DNA抑制核酸合成，还能激活肿瘤细胞线粒体的NOX4蛋白产生双氧水，进而与Fe2+发生相互作用而产生脂质过氧化物，诱导BID、AIF和EndoG等蛋白的表达，从而通过铁死亡和损伤DNA 的组合效应而诱导肿瘤细胞死亡，展现出优越的临床应用前景（图5 D,E,F）。
图5. 含铁碳酸钙药物组装体体外诱导肿瘤细胞死亡效应及其分子作用机制。
要点5：考察含铁碳酸钙-阿霉素组装体的体内蓄积及其靶向效应
为了进一步考察含铁碳酸钙-阿霉素组装体的体内蓄积及其靶向效应，通过小动物活体成像考察了CY5标记的含铁碳酸钙-药物组装体在肿瘤组织以及体内重要组织的分布。研究结果表明，含铁碳酸钙-阿霉素组装体（ACC@ DOX.Fe2+-CaSi-PAMAM-FA/mPEG）能够更好的蓄积与肿瘤组织，其蓄积效果明显高于其他实验组（图6）。这是因为PEG分子的修饰提高了含铁碳酸钙-阿霉素组装体的体内循环时间；当该组装体通过EPR效应到达肿瘤部位时，过表达的金属基质蛋白酶2（MMP-2）能解离PEG并暴露出叶酸分子，从而提高了肿瘤组织蓄积量和肿瘤细胞的吞噬效率。
图6. 含铁碳酸钙药物组装体的活体组织分布。
最后，研究人员还建立了4T1乳腺癌和A375黑色素瘤两种肿瘤模型，考察了含铁碳酸钙-阿霉素组装体的活体疗效（图7）。研究结果表明，含铁碳酸钙-阿霉素组装体（ACC@DOX.Fe2+-CaSi-PAMAM-FA/mPEG）能够更好的抑制活体肿瘤的生长并降低了DOX等药物的毒副作用；患瘤老鼠经治疗后，生存时间也得到了明显的延长。研究结果证实含铁碳酸钙-阿霉素组装体不仅具有很好的生物安全性和可降解性，疗效也得到了最大程度的提升。
图7. 含铁碳酸钙药物组装体的体内疗效评价。
小结
阿霉素是最为经典的、广泛应用于肿瘤临床治疗的化疗药物之一；该研究发现阿霉素和二价铁离子的配位共传输能够最大程度的增进其疗效，不仅能维持其化学凋亡效应并能激发肿瘤细胞的铁死亡，这对于今后临床治疗将具有非常重要的意义，也为其未来应用奠定了基础。这项研究发展了通过无定形碳酸钙和铁离子-阿霉素的配位作用，一步法原位生长出肿瘤微环境响应性负载阿霉素-亚铁离子的无定形碳酸钙纳米制剂，提出了靶向诱导肿瘤细胞化疗凋亡和铁死亡的协同治疗策略，将具有非常重要的临床应用前景。
论文链接
Chen-Cheng Xue, et al. Tumor microenvironment-activatable Fe-doxorubicin preloaded amorphous CaCO3 nanoformulation triggers ferroptosis in target tumor cells. Science Advances. 2020.
DOI: 10.1126/sciadv.aax1346
https://advances.sciencemag.org/content/6/18/eaax1346/tab-article-info