华南理工大学类分子发光金属纳米探针课题组2019年主要工作进展

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刘锦斌，男，教授/博导。2014年7月入职华南理工大学，，广东省杰出青年科学基金获得者。近年来，在J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Nano、Adv. Funct. Mater.、Small 和Anal. Chem.等国际高水平期刊上发表SCI论文近60篇（其中第一或通讯作者论文24篇）。

该课题组自建立以来，一直从事类分子发光金属纳米探针的研究工作。类分子发光金属（如，Au、Ag和Cu）纳米探针是一类兼具纳米材料与小分子特性的新型光学探针，具有超小的尺寸（d < 3.0 nm）和独特的光学性质，在生物标记、传感和成像等研究领域中备受关注。该课题组以推动类分子发光金属纳米探针的临床应用为科学目标，在类分子的发光金属纳米探针的合成、自组装及生物医学成像与光学传感等方面开展积极地探索与研究。

刘锦斌教授课题组成员

以下简要介绍该课题组2019年部分科研工作进展。

（一）原位制备稳定且高度可控的发光铜纳米粒子组装体

类分子发光铜纳米粒子（CuNPs）由于其原料廉价易得、表面易功能化和光学性质优异等特性，最近受到广泛关注。然而，超小CuNPs通常具有大的表面能，在空气中容易被氧化而难以应用。因此，将不稳定的超小纳米颗粒在水溶液中组装成均匀的纳米结构，并具有优异的稳定性和可控性仍是具有挑战性的课题。

图1. 组装体封装CuNP数目的调控。（a）通过改变模板的嵌段数制备封装CuNPs数目可控的组装体示意图；（b-d）使用Pluronic F68（b）、F108（c）和F127（d）作为模板的CuNP组装体的HAADF-STEM图；（e）单个组装体中封装CuNP的数量分布；（f）组装体中CuNP的粒径分布图。

该课题组利用尺寸和形状可控的两亲性三嵌段共聚物为模板，提出了一种原位合成具有CuNPs可控封装和高稳定性的强发光CuNP组装体的简便且稳健的制备策略。获得的CuNP组装体在模板的疏水区域通过疏水相互作用进行合成和自组装，并在表面被亲水性聚（乙二醇）（PEG）有效地包裹。通过改变模板的嵌段数，可改变组成组装体交联超小CuNPs组成的数目（图1）。通过多齿硫醇配体的交联大大增强了Cu纳米组装体在生理环境中的发光强度和稳定性。由于其在生理环境中任保持高效的发光特性和良好的稳定性，CuNP组装体可成功地进行细胞成像（图2）。该研究提供了一种制备稳定和可控的超小金属纳米粒子组装体的简便可行的方法，可用于构建更多、更加可控和稳定的类分子发光金属纳米粒子组装体，将进一步拓展不稳定发光金属纳米粒子的应用领域。该研究工作发表在Journal of the American Chemical Society上（J. Am. Chem. Soc., 2019, 141, 2852−2856）。

图2. CuNP组装体的细胞成像实验。（a）CuNP组装体在HeLa细胞中孵育不同时间的明场和荧光场的叠加以及三维（3D）荧光成像；（b）CuNP组装体与GFP标记溶酶体间的共定位分析。

（二）pH刺激形貌和光学双重响应的发光金纳米粒子组装体及其细胞内成像

类分子发光金纳米粒子（AuNPs）由于其尺寸小（d < 3.0 nm），可以像小分子探针一样通过肾脏排出体外而具有低纳米毒性和动物体内滞留少的特点，使其在生物医学领域具有较好的应用前景。相比于大尺寸的AuNPs，类分子AuNPs与细胞的相互作用比较弱，难以到达特定的亚细胞器，因而限制了其在细胞内成像、定位和追踪等领域的研究。因此，发展新型的组装策略以提高超小发光AuNPs与细胞的相互作用及其在特定亚细胞器内的光学响应性能具有重要的研究意义。

图3. 类分子发光AuNPs的自组装。a）组装示意图；b）pH光学响应图；c）pH光学响应可逆性表征；d，e）形貌可逆性示意图（d）及TEM表征图（e）。

该课题组以一种常见阳离子聚合物壳聚糖为模板分子制备出具有pH依赖型结构溶胀特性和高灵敏荧光响应的AuNPs组装体（图3）。相比于以强阳离子聚合物PEI为模板形成的组装体，这种以等电点为～6.5的壳聚糖为模板进行静电自组装所得到的组装体AuNPs@CS具有灵敏的pH形貌和光学双重响应特性。当pH < 6.5时，AuNPs@CS组装体以球形紧密堆积的状态存在，其粒径为～23.5 nm，组装后其荧光量子产率提高了3倍；当pH > 7.4时，AuNPs@CS组装体发生形貌溶胀且伴随灵敏的荧光减弱响应。这种静电自组装有效地增强了细胞对超小发光AuNPs的摄取能力，相比于组装前的纳米粒子，细胞对AuNPs@CS组装体的摄取量提高了15倍。此外，在溶酶体中（pH < 6.5）AuNPs@CS组装体荧光增强且表面电荷由负转变为正，可促进纳米粒子实现溶酶体逃逸进入细胞质（pH ～7.4）并伴随着灵敏的光学响应。这种灵敏的光学响应特性可以清楚地指示AuNPs的细胞内吞及其溶酶体逃逸过程（图4）。因此，该组装策略可以更好地帮助理解细胞与功能纳米粒子的相互作用，为设计新型具有高效溶酶体逃逸与高灵敏细胞内亚细胞器定位追踪的智能响应型组装材料提供了一种思路。该研究工作发表在Analytical Chemistry上（Anal. Chem., 2019, 91, 8237−8243）。

图4. 类分子发光AuNPs组装体的亚细胞器定位。a）细胞内吞及溶酶体逃逸过程的示意图；b）进入细胞后溶酶体逃逸过程的光学表征及溶酶体GFP荧光与类分子发光AuNPs组装体的荧光共定位表征。

（三）类分子发光金纳米粒子的表面覆盖度调控及其细胞相互作用

如上所述，类分子发光AuNPs与细胞的相互作用较弱，其与细胞相互作用调控层次的研究比较少，细胞作用机制也不明确，从而限制了类分子发光AuNPs的进一步医学转化研究。随着AuNPs尺寸的减小，类分子发光AuNPs不仅具有常规无机纳米材料的特性，还表现出了类分子特性。由于比表面积急剧增加，表面配体对其光学性质及生物学作用机制的影响愈发明显。

图5. 类分子发光AuNPs的表面覆盖度与细胞作用的关系图。

该课题组通过研究超小发光金纳米粒子表面覆盖度的研究发现，改变发光AuNPs的表面覆盖度不仅可调控发光AuNPs的光学性质而且可精准调控及其与活细胞的相互作用（图5）。通过调控类分子发光AuNPs的表面配体覆盖度（07CR-AuNPs、09CR-AuNPs、13CR-AuNPs，表面覆盖度由29%增加至47%），成功合成了具有近红外光、近红外光-可见光双发射光、可见光发光的系列AuNPs。此外，通过细胞的三维成像研究发现不同配体密度的发光AuNPs在与细胞的作用上也表现出明显的差异：低配体密度的类分子发光AuNPs与细胞作用较快，有较强的细胞膜结合能力及附着能力（~82%，共培养6 h）；而高配体密度的超小发光金纳米粒子与细胞作用较慢，与细胞膜结合能力弱，细胞内化量多。通过改变发光AuNPs的表面配体密度不仅可以控制其与细胞作用的速率与效率，还可以实现了其在亚细胞层次分布的精准调控。双发射的发光AuNPs对pH具有灵敏的响应，结合比率成像技术可对细胞内的pH进行实时监测，可用于反映细胞的状态、功能及其相应机制的研究（图6）。本研究对类分子发光AuNPs在细胞层次上的研究不仅为纳米粒子的设计合成提供了新的思路，也有助于类分子发光AuNPs的医学转化研究。该研究工作发表在ACS Nano上（ACS Nano, 2019, 13, 1893-1899）。

图6. 活细胞荧光及比率荧光三维成像图。（A-C）谷胱甘肽与跨膜多肽双配体共修饰的双发射09CR-AuNPs；D-F）谷胱甘肽单配体修饰的双发射09GS-AuNPs；（G）比率荧光三维成像中AuNPs 双波长发射强度比率（I_810nm/I_615nm）大于3 所占百分比统计值；（H）AuNPs 与溶酶体示踪绿的重合度统计值。

（四）表面调控刺激响应的双发射金纳米粒子及其比率成像

随着AuNPs尺寸减小，类分子发光AuNPs的光学性质不仅与其尺寸（即金原子个数）有关，而且还受其表面硫醇配体性质的影响（如配体极性、电荷及给电子能力等）。类分子AuNPs的表面配体是构成金内核与外界环境的界面，可以影响其与环境中外源分子的相互作用。在生物体系中富含氨基类的富电子分子如氨基酸、多肽与蛋白质等，这些外源型生物胺分子是否会对类分子发光AuNPs的光学性质产生刺激响应？

图7. 类分子发光AuNPs的刺激光学响应。a）类分子发光AuNPs的表面配体修饰示意图；b-d）三种AuNPs（b，MPS-AuNPs；c，MPA-AuNPs；d，PEG-AuNPs）与乙二胺作用前后的荧光光谱图；e）三种AuNPs与不同浓度胺分子作用后的比率荧光成像图。

针对上述问题，该课题组通过对类分子发光AuNPs的表面配体进行了不同亲电性设计，在与外源性富电子胺分子相互作用过程中，研究表明配体的亲电性决定了AuNPs吸附胺分子的能力，从而产生不同程度的光学刺激响应。AuNPs表面的强亲电性配体可以将胺分子拉到AuNPs表面，使得空间位阻小、电子密度高的胺分子能穿透AuNPs表面配体屏障，从而靠近金核发生电子转移，产生新的高能发射峰，由原来的810 nm单发射变为同时具有600 nm和810 nm的双发射（图7）。由胺分子引起的AuNPs由810 nm单发射荧光峰形成同时具有600 nm和810 nm双发射荧光峰，其双发射峰强度比率I_{600 nm}/I_810nm与胺分子的浓度及其结构有关，因而可以用来构建刺激响应型生物胺分子探针（如实时监测早期鱼类变质过程，图8）。这种由外源性物质引起的荧光响应机制为进一步的定量生物分析、生物成像及传感提供了一种新方法。该研究工作发表在Advanced Functional Materials 上（Adv. Funct. Mater., 2019, 29, 1806945）。