Adv Sci | 欧阳松应/罗招庆组合作揭示嗜肺军团菌高度同源的2个蛋白在泛素化调控中功能截然相反的机理

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细胞内的信号传导通常由不同类型的翻译后修饰（PTMs）调节，从而改变信号通路中关键分子的活性，以便对生长发育的信号或外界环境的刺激做出快速准确的反应。目前为止已有200多种类型的PTMs被发现，而泛素化则是其中应用最为广泛的类型之一【1】。常规泛素化反应通过泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3依次反应最终将泛素Ub连接到目的蛋白上【2】。

“知己知彼，百战不殆”，嗜肺军团菌在与宿主长期的进化过程中早已摸清了宿主信号传导的常规路数，在感染的早期派出先遣部队“开路布防”。据统计，嗜肺军团菌利用Dot/Icm IV型分泌系统向宿主细胞注入约330种效应因子【3】。其中已有17种被鉴定出具有E3泛素连接酶的活性，与宿主内的E1和E2合作形成新的泛素调控网络，修饰宿主中的关键分子，为军团菌的侵染提供条件【4】。这些先遣部队中除了善于潜伏的“地下工作者”外，也有一些身怀绝技的“特种兵”。2016年美国普渡大学罗招庆课题组率先发现SidEs家族的蛋白可以催化不依赖于E1、E2和E3的非经典泛素化途径，SidEs家族的效应蛋白的mART结构域消耗一分子NAD对泛素分子的第42位精氨酸进行修饰生成反应中间体ADRP-Ub，从而激活泛素【5】，之后Ivan Dikic和Ralph R. Isberg课题组进一步丰富了该研究，SidE家族效应蛋白的PDE结构域对中间体ADRP-Ub进行切割，将PR-Ub连接到底物丝氨酸残基上【6】。这些研究改变了人们对传统的泛素化三酶机制的认识（罗招庆组揭示独特的细菌去泛素化酶可逆转磷酸核糖连接的泛素化——附专家点评）。

通过效应蛋白对细胞内环境的调控，嗜肺军团菌成功实现免疫逃逸侵染宿主。然而“致之于死地”并不是病原菌的目的，“改造环境，为我所用”才是长久之道。因此，细菌进化出了相应的逆转泛素化的机制。2017年，罗招庆课题组在Cell Research上报道了SidJ具有逆转SidE家族蛋白介导的磷酸核糖泛素化的功能【7】；2019年，罗招庆课题组与欧阳松应课题组合作发现SidJ是一个依赖于宿主细胞钙调蛋白（CaM）的谷氨酸修饰酶（glutamylase），修饰SidE家族的mART，抑制其功能。该研究不仅揭示了效应蛋白间新的活性调控方式，而且为探讨谷氨酸修饰酶的催化机制提供了新的体系（详见BioArt报道：专家点评Nature | 罗招庆/欧阳松应合作解析一种谷氨酸化修饰的新机制）【8】；随后茅毓新课题组与Ivan Dikic课题组分别在PNAS和Molecular Cell上发表了DupA（lpg2154）和DupB（lpg2155）是针对磷酸核糖泛素化途径的去泛素化酶（详见BioArt报道：PNAS | 茅毓新组发现非典型去泛素化酶）【9】。

2018年，罗招庆组在Nature Microbiology发文揭示了嗜肺军团菌的效应蛋白MavC是一个谷酰胺转氨酶，催化泛素的Q40位点和E2结合酶UBE2N的K92和K94以异肽键交联，从而对UBE2N进行泛素化修饰，这是不同于SidE家族效应蛋白的另外一种非经典泛素化的机制，MavC 通过介导UBE2N的泛素化修饰抑制NF-κB的激活，从而抑制宿主的先天性免疫，有利于嗜肺军团菌的侵染（详见BioArt报道：Nature Microbiology丨罗招庆实验室揭示新型非经典泛素化途径）【10】；2019年罗招庆课题组与欧阳松应课题组再度合作在The EMBO J杂志上报道了MvcA与其底物UBE2N-Ub复合物的高分辨率晶体结构，揭示了MvcA对UBE2N-Ub去泛素修饰的机制，经MvcA去泛素的UBE2N恢复其E2泛素结合酶的功能，重新参与NF-κB通路的激活，恢复部分宿主的正常功能，使嗜肺军团菌与宿主“和平共处”（详见BioArt报道：EMBO J | 罗招庆/欧阳松应揭示谷酰胺脱氨酶MvcA的去泛素化功能）【11】。有趣的是，MvcA和MavC在蛋白序列（50%相同）和结构上高度相似，二者是如何发挥截然相反的生化功能的呢？研究人员展开了深入的研究。

2020年4月30日，欧阳松应课题组和罗招庆课题组再度合作在Advanced Science上发表了题为“Molecular basis of ubiquitination catalyzed by the bacterial transglutaminase MavC”的研究论文。这是该合作团队继2019年7月份在Nature、年底在The EMBO J以及2020年2月份在J Biol Chem上发表军团菌相关研究后的又一重要进展。

该工作解析了MavC与UBE2N-Ub的三元复合物晶体学结构（图1），MavC由Tail 结构域、Core 结构域和Insertion结构域三部分组成，UBE2N-Ub横跨在Tail 结构域和Insertion结构域之间，Core 结构域位于UBE2N-Ub的下方，起到支撑的作用。

 图1 MavC-UBE2N-Ub的晶体学结构

作者发现MavC-UBE2N-Ub与MvcA-UBE2N-Ub的不仅在结构组成上高度相似（图2），而且UBE2N-Ub在MavC和MvcA中的相对位置也是相似的，活性中心均是由Cys-His-Gln构成的催化三联体。

然而通过MavC与MvcA一系列结构的比对分析我们发现位于催化三联体附近的MavC_W255和MvcA_F268是维持泛素化和去泛素化功能的关键位点，W255的疏水性小于F268，前者有利于维持K92-Q40之间异肽键的稳定，而后者不利于异肽键的稳定。与该推测相符的是这两个位点的突变导致泛素化与去泛素化活性不同程度的逆转（图3）。

此外，酶与底物/产物的亲和力分析研究人员发现，MavC的Insertion 结构域与Tail 结构域的逆时针旋转使得UBE2N与Ub在空间上更易接近，Tail 结构域与Ub之间的静电引力也促进了MavC与Ub的结合，MavC与底物UBE2N和Ub的稳定结合有利于MavC催化UBE2N与Ub向异肽键合成的反应方向进行；而MvcA的Tail 结构域与MavC的Tail 结构域的旋转方向相反，呈顺时针转动，且MvcA的Insertion 结构域与UBE2N的亲和力、Tail 结构域与Ub的亲和力都低于它们在MavC中的亲和力，MvcA与产物UBE2N和Ub的低亲合力有利于催化反应向异肽键断裂的方向进行（图4，动画1）。显然，病原细菌在与宿主的长期斗争中，在最大限度节省能量的前提下，通过对酶的关键位点细微的“偷梁换柱”而衍生出复杂，精确和高效的调控机制。