Nature | 薛愿超团队开发全景式解析细胞内RNA原位高级结构及作用靶标的新技术RIC-seq

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作为生命起源的最初分子形式，RNA不仅可以像DNA一样携带遗传信息，而且还可以像蛋白质一样具有酶的催化功能。20世纪80年代初，核酶的发现是RNA研究领域的里程碑，它告诉我们特定的RNA分子在形成复杂的三级结构后可具有酶的催化活性。与核酶类似，在细胞内的分子海洋中，绝大多数RNA都会通过分子内的碱基配对形成二级结构，并在RNA结合蛋白的介导下经过进一步折叠而形成复杂的三级结构。高度结构化的RNA进而通过与其他RNA分子相互作用以发挥生物学调控功能，因此，解析RNA的高级结构及空间作用靶标是研究其功能机制的关键。

目前高通量研究RNA二级结构和相互作用的技术主要有icSHAPE、DMS-seq、PARIS、CLASH和hiCLIP等，这些方法极大的促进了我们对巧夺天工的RNA二级结构的理解。但是，目前的这些技术方法仍存在一些局限性：1）由于化学修饰不能有效的进入蛋白质所保护的区域以及RNA修饰位点，导致这些方法捕获的RNA单链区和双链区信息不完整；2）CLASH和hiCLIP需要过表达特定的RNA结合蛋白，这往往会破坏细胞内生理条件下的RNA-RNA相互作用；3）PARIS、CLASH和hiCLIP等在体外进行近端连接，这会产生大量非生理条件下的假阳性连接信号；4）现有方法不能准确捕获非Watson-Crick配对和远距离的loop-loop相互作用，而此两类信息对于重构RNA的高级结构是至关重要的。

为了解决上述问题，2020年5月6日，中国科学院生物物理研究所薛愿超课题组在Nature杂志上发表了文章“RIC-seq for global in situ profiling of RNA–RNA spatial interactions”，创建了能够全景式解析细胞内RNA原位高级结构及作用靶标的新技术RIC-seq，为后续深入研究非编码RNA结构动态变化的功能性以及作用机制提供了全新的实验工具。

RIC-seq技术的基本流程是对细胞进行甲醛交联以固定蛋白质介导的RNA-RNA原位相互作用（图1a），之后在保持细胞完整性的情况下进行膜穿孔，并利用微球菌核酸酶处理以去除游离的RNA片段；然后在RNA的3’末端进行pCp-biotin标记并在原位进行近端连接；最后，裂解细胞，提取总RNA，纯化含有C-biotin标记的嵌合体RNA片段进行建库测序。

研究发现：1）pCp-biotin可高效的标记和筛选嵌合体RNA (图1b)；2）RIC-seq可准确捕获pre-miRNA和TERC等各种类型非编码RNA的二级结构(图1c-e)；3）RIC-seq可鉴定U1 snRNA在MALAT1上的作用位点(图1f, g)；4）并可准确解析28S rRNA的原位高级结构(图1h, i)。

图1 RIC-seq可准确捕获RNA的原位高级结构及作用靶标。

利用RIC-seq技术，该研究解析了HeLa细胞中mRNA和非编码RNA的高级结构及相互作用靶标（图2a, b）。基于分子内部的RIC-seq数据，发现pre-mRNA和非编码RNA上都存在高度结构化的RNA拓扑结构域（RNA topological domain）（图2d），并且RNA拓扑结构域边界富集外显子及多种RNA结合蛋白，暗示剪接过程及蛋白质的结合会介导RNA内部形成分离的拓扑结构域。根据分子间相互作用强弱，该研究鉴定了一类与其他RNA分子存在广泛相互作用的RNA，定义为hub RNA，其中包括MALAT1、NEAT1及CCAT1等著名的长非编码RNA（图2e）。除此之外，95%的hub RNA为pre-mRNA，尤其是具有超长内含子（>50 kb）的pre-mRNA，这提示在完成剪接之前，pre-mRNA有可能会发挥类似长链非编码RNA的调控功能。

图2 RNA结合蛋白介导的RNA-RNA相互作用的全貌。

增强子与启动子之间通过远距离配对可激活转录，他们的对应调控关系是现代生物学研究的热点和难点。虽然利用CRISPR-dCas9可以筛选单一基因座周围数兆碱基范围内的增强子元件，但成本较高且通量低。该研究根据启动子和增强子区可转录生成非编码RNA（uaRNA, promoter upstream antisense RNA; eRNA, enhancer RNA）的特点，通过分析意外发现eRNA和uaRNA之间存在广泛的相互作用，而且该作用往往发生在TAD结构域内部，这提示可以利用eRNA和uaRNA的空间邻近作用来推断增强子和启动子的对应调控关系（图3a, b）。

基于增强子-启动子RNA之间的相互作用，研究人员构建了增强子-启动子作用网络图谱（图3b）；利用LNA介导的eRNA敲降实验，检测了7个增强子所对应调控的31个启动子，验证准确率可达90%（图3c），首次证明了通过eRNA和uaRNA的相互作用信息可准确推断增强子-启动子的调控关系。发现与普通的增强子相比，超级增强子往往可调控多个启动子，对应的RIC-seq信号强度更强，而且作用距离也更远（图3d-g）。研究人员进而利用RIC-seq数据构建了全基因组增强子-启动子调控网络图谱，发现利用这些调控关系可准确的重现单一染色体在细胞内的领域特征(图3h)。以上结果为系统研究eRNA在细胞核内的调控功能奠定了基础。

图3 增强子-启动子RNA作用网络图谱。

进一步，研究人员注意到一个超级增强子638，发现它与长链非编码RNA CCAT1基因座重叠，并且可调控MYC基因的转录（图4a）。结合RNA-seq数据和cDNA末端快速扩增技术，研究人员在HeLa细胞中鉴定了一个新的CCAT1异构体，命名为CCAT1-5L。该长非编码RNA的5’端与MYC的启动子RNA和增强子RNA PVT1存在广泛的远距离相互作用。利用LNA敲降、CRISPR-Cas9敲除和CRISPR干扰等多种手段下调CCAT1-5L的表达后，MYC基因的转录显著下降。有意思的是，染色质构象捕获分析发现从CCAT1-5L超级增强子区到MYC启动子和增强子区的染色质环化效率也显著降低（图4c），说明超级增强子RNA与启动子RNA之间的互作可调控染色质构象。

为了解析超级增强子RNA CCAT1-5L激活MYC转录的详细分子机制，研究人员利用ChIRP-MS、CLIP-seq、ChIP-qPCR等手段，发现RNA结合蛋白hnRNPK可与CCAT1-5L、MYC启动子RNA和增强子RNA PVT1相互作用，并通过多聚化把RNA聚合酶II从超级增强子区递送到MYC的启动子，从而促进MYC基因的转录（图4e, j）。

图4 超级增强子RNA CCAT1-5L通过改变染色质构象调节MYC转录。

综上所述，该工作建立了能够捕获RNA原位高级结构和作用靶标的RIC-seq新技术，揭示了RNA的空间组织规律与特征，证明了启动子和增强子RNA之间的互作可用于推导其调控网络，并阐明了超级增强子长链非编码RNA CCAT1-5L可与RNA结合蛋白hnRNPK、MYC启动子和增强子RNA结合以改变染色质构象，进而调控癌基因MYC转录的新机制。

薛愿超课题组博士研究生蔡兆奎、副研究员曹唱唱和吉蕾为该论文的共同第一作者，薛愿超研究员为通讯作者。生物物理研究所何顺民研究员、河南师范大学杨献光副教授、信阳师范学院王磊讲师及其团队成员参与了该项研究。该项研究工作得到了生物物理研究所蛋白质科学研究平台和遗传与发育生物学研究所成像平台的帮助。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2249-1

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