Angew：识别单个氨基酸，SERS迈向单分子蛋白质测序
第一作者：黄建安
通讯作者：Denis Garoli、黄建安
通讯单位：意大利理工学院
研究亮点：
1. 利用金纳米星与金纳米孔壁之间的单个热点，实现了到了单分子SERS探测。
2. 通过分子动力学模拟与实验SERS谱图详细研究了多肽在金表面的吸附和运动状态。
蛋白质测序面临挑战
蛋白质是所有生命过程的重要参与者，蛋白质的一级结构，即氨基酸的排列顺序决定了蛋白质高级结构和功能，是现代生命科学进行蛋白质结构功能分析中很重要的分析目标。精确、快速、便捷的实现蛋白质一级结构分析，对于理解生命活动过程，疾病的早期诊疗具有重要的意义。例如，在可预见的未来，开发出手持式单分子蛋白质测序仪，与医疗数据库结合，病人在家中即可实现早期疾病诊断。这将是医疗领域革命性的突破，具有广阔的发展空间和市场前景。
目前蛋白质测序常用的是质谱（Mass Spectroscopy），需要首先把蛋白质切碎成多肽，然后再离子化多肽使得多肽链上的氨基酸有了电荷，再通过质量/电荷比来确定多肽中氨基酸的顺序，再比对蛋白质数据库还原切碎前的蛋白质。质谱仪器巨大，灵敏度低，需要至少一百万个多肽分子才能得出有意义的数据，对于测试生物体液中的占少数的蛋白质无能为力，质谱的这些缺点成为不仅是蛋白质测序而且是蛋白质组学(Proteomics)的重大瓶颈。
科学家于是寄希望于在基因测序取得重大成功的纳米孔单分子测序。但是，对于单分子蛋白质测序，相比于在单分子DNA测序中只用到4种碱基作为基本结构单元，蛋白质由20个不同的氨基酸组成，使得单分子蛋白质测序变得更为复杂。因为组成蛋白质氨基酸数量众多，无法通过离子电流等手段直接识别。目前各大研究机构和公司正在研究使用荧光标记20种氨基酸并通过单分子荧光来识别，但是仍然难于登天，一方面将不同染料分子连接到蛋白质链的每个氨基酸已经是接近不可能的任务。另一方面荧光的发光峰太宽，以至于不同染料分子的发光光谱相互交叠难以分辨，无法实现准确识别。表面增强拉曼光谱（SERS）利用贵金属表面等离子体共振产生的电磁场增强（热点），将吸附于其中的探测分子拉曼信号提高1010数量级，实现了对DNA等物质的单分子级探测。就如之前提到的《单分子SERS：第一次，测全了4个碱基的单分子基因测序》描述的那样，SERS光谱在单分子分析中具有很大优势，例如狭窄的“指纹峰”有助于多路识别，抗光漂白和无须标记。
SERS在对多肽中氨基酸的识别，仍然有不少困难。一方面，由于携带苯环的氨基酸具有较大的拉曼散射截面，导致其它氨基酸的拉曼信号被完全覆盖。另一方面，由于对蛋白质的分析需要分散在溶液中进行，由于在金属表面复杂的运动过程，如吸附、脱附、翻转等，导致产生的拉曼信号出现飘动和展宽。因此，目前SERS研究无法精确识别单个氨基酸，特别是不含苯环的氨基酸。这些极大限制了SERS应用于单个蛋白质测序。
成果简介
为此，意大利理工学院Francesco De Angelis研究团队将蛋白质或氨基酸分子吸附于金纳米星上，通过施加电等离子体力（electro-plasmonic force）将粒子推进并约束在金纳米孔内，如图1所示，利用金纳米星与金纳米孔壁之间的单个热点，实现了到了单分子SERS探测，用于探测氨基酸和分辨仅含有两个不同氨基酸单元的单个多肽分子抗利尿激素（Vassoprein）和催产素（Oxytocin），并结合分子动力学模拟对照实验谱图，详细研究了多肽在金表面的吸附和运动状态。该系统被证实具有与氨基酸尺寸可比拟的高空间分辨率，可以无标记的精确识别多肽链上的单个氨基酸，为之后的单个蛋白测序打下了坚实的基础。
图1. 纳米星微流系统构成。
要点1：首次实现了10种不同氨基酸的单分子SERS分析
通过浓度控制，作者将单层氨基酸覆盖在金纳米星表面，史上首次得到了10种不同氨基酸分子的单分子信号（图2），演示了纳米星系统优越的单分子谱线分辨率。
图2. 10种单分子氨基酸SERS谱，从上往下是: Leu, Gln, Asn, Ile, Arg, Pro, Phe , Tyr, Cys, Gly。
所谓单分子谱线分辨率，是当单分子SERS信号和多分子SERS信号相比时，具有更窄的峰宽。如图3所示，位于899cm-1处的CH2峰在单分子信号中峰宽仅有7cm-1，然而多分子SERS信号峰宽在15cm-1左右分布，并且重复性很差。这是由于在多分子情况下，吸附在粒子表面多个热点附近的分子具有不同的构象，并且在溶液中不停的运动，从而将信号峰展宽。
图3. 单分子氨基酸SERS与多分子SERS信号对比。
要点2：成功实现单个多肽分子中氨基酸组分识别
为了进一步验证纳米星系统的空间分辨率，作者选择了两种常用的多肽: Vassoprein和Oxytocin，结构组成如图1所示。这两个多肽具有相同的氨基酸数量和相似的结构。不同的是在3号和8号位置上的氨基酸不同。纳米线微流系统的谱图如图4所示，Vassoprein和Oxytocin的3号和8号位氨基酸被清晰的探测到了，史上第一次实现了单分子Vassoprein和Oxytocin的分辨。
图4. 其中a-d是氨基酸Vassoprein的SERS谱图，e-h是Oxytocin的SERS谱图。
要点3：通过分子动力学模拟与实验SERS谱图结合解释了氨基酸的构象变化
作者不仅测出了结构信息。还通过SERS谱观察到多肽在金表面的构型相关信息。例如结合电场激发拉曼峰的原理，Phe、Tyr和Pro等含苯环的氨基酸的面内呼吸振动模式的缺失，是由于其在金表面采取一种“平躺”的模式。据此，作者做了两种多肽在金表面的分子动力学模拟（图5），其中Tyr，Phe和Pro残基均平躺在表面，与SERS光谱中得到的结果一致，证实了该分子动力学模型的正确性。
此外，该模型很好地解释了其他不含苯环的氨基酸的动力学，模拟发现带有苯环的残基趋向于接触金表面，并且阻止其它不带苯环的残基靠近，因此它们的SERS光谱往往盖过了不带苯环的残基，实验之所以能观察到无苯环氨基酸，是因为与氨基酸尺寸可比拟的单个热点所致。通过模拟，更加深入的证明了能观察到多肽内单分子氨基酸残基的信号，是因为光学牵引力的作用克服了热运动效应。光学牵引力对稳定单个分子在热点中，起了至关重要的作用，这对于深入了解亚纳米级尺寸光与物质相互作用提供了新的理解。
图5. Vassopresin在金表面最可能构象的分子动力学模型。
小结
作者演示了单个SERS热点对于单个蛋白质分子检测的优越空间分辨率和谱线分辨率，但是单分子蛋白质测序还有很多问题尚待解决，例减慢蛋白质流速、热点稳定性调控等。作者希望有更多SERS同行、单分子/单粒子操控、DFT模拟、分子动力学模拟和生物信息学专家参与和合作，有兴趣的同行欢迎加入“纳米人SERS”QQ群（群号：529847278）来一起探讨。
参考文献
Huang J A , et al. Multiplex discrimination of single amino acid residues in polypeptides by single SERS hot spot. Angewandte Chemie International Edition, 2020.
DOI: 10.1002/anie.202000489
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202000489
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