【泌尿系结石合并感染的诊治】输尿管支架管结壳患者尿液菌群的分布特点

来源：中华泌尿外科杂志公众订阅号

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作者：倪永梁1 魏巍1 王祥涛1 孙晓璐1 黄忠献2 王博3 李明杰1 蒋德启1  李运伟1 魏强1 刘霞1 史本康4

作者单位：

1山东省立第三医院泌尿外科

2山东省济南市中心医院泌尿外科

3山东省济南市济钢医院泌尿外科

4山东大学齐鲁医院泌尿外科

引用本文：

倪永梁，魏巍，王祥涛，等. 输尿管支架管结壳患者尿液菌群的分布特点[J].中华泌尿外科杂志，2020，41（4）：262-266. DOI：10.3760/cma.j.cn112330-20200206-00067.

摘要

目的

探讨输尿管支架管结壳患者尿液菌群的分布特点。

方法

选取2018年10月至2019年3月在山东省立第三医院、山东大学齐鲁医院、济南市中心医院和济南市济钢医院就诊的35例输尿管支架管置入术后患者。纳入标准：年龄18～65岁；输尿管镜碎石术后留置内支架管4周。排除标准：尿液细菌培养阳性；严重肉眼血尿；近期口服抗生素；存在明显残石患者。本研究采用横断面研究方法（临床研究注册号为ChiCTR1800020025），根据有无支架管结壳将患者分为结壳组23例和无结壳组12例。收集拔管当日患者尿液行细菌16s DNA检测。使用UPARSE、UCHIME和RDP calssifier等软件分析两组患者尿液菌群分布特点，明确两组患者尿液中细菌种类总数、细菌丰度，以及丰度占比较大的细菌类别，比较两组患者尿液细菌种类、数量及细菌丰度的差异，明确结壳组患者尿液中丰度占比较大的细菌菌属。

结果

两组患者的年龄、性别、体质指数、置管侧别、内支架管型号及结石成分差异均无统计学意义（P＞0.05）。16s DNA检测结果显示，结壳组丰度占比＞1%的菌属数量为11个，丰度占比＞0.01%的菌属数量为74个；无结壳组丰度占比＞1%的菌属数量为7个，丰度占比＞0.01%的菌属数量为11个，两组丰度占比＞1%的菌属数量比较差异有统计学意义（t=5.12，P=0.000）。结壳组中菌属丰度占比前3位分别为乳杆菌属（23.1%）、拟杆菌属（18.8%）和未分级拟杆菌属（17.1%），非结壳组中菌属丰度占比前3位分别是为埃希菌-志贺菌属（32.2%）、肠球菌属（24.9%）和假单胞菌属（18.2%）。两组间差异最大的3种细菌是乳杆菌属（P=0.010），拟杆菌属（P=0.004）和未分级拟杆菌属（P=0.004）。

结论

支架管结壳患者尿液中细菌种类和数量都明显多于非支架管结壳患者。拟杆菌属细菌在支架管结壳患者尿液中的细菌种类丰度较大。

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输尿管支架管是泌尿外科常用的医用耗材，随着输尿管支架管在临床上的广泛应用，其相关的并发症也逐渐出现，例如支架管结壳、腰腹部不适、下尿路症状、血尿、感染及性功能障碍等[1-2]，其中支架管结壳是一种重要并发症。支架管结壳会导致引流作用下降、泌尿道黏膜损伤、血尿、拔管疼痛等情况，严重结壳会导致泌尿道梗阻和拔管困难，可降解输尿管支架管的应用可能会成为一种重要的解决方案[3]。目前已知的输尿管支架管结壳的病理机制为脲酶阳性微生物分解尿素，导致尿液pH值升高，进而促进尿液中晶体在支架管壁上聚集、生长[4]。

近年来，随着细菌基因检测技术的广泛应用，既往通过常规细菌培养技术无法获得的细菌种群数量及各个种群所占比例均可通过细菌基因检测技术来明确[5-6]，这为我们开展相关研究创造了条件。本研究采用细菌16s DNA检测技术对输尿管支架管结壳患者尿液菌群的多样性进行初步研究，探讨此类患者的尿液菌群分布特点。

对象与方法

一、纳入标准和排除标准

纳入标准：年龄18～65岁；均行经尿道输尿管镜碎石术，术中置入含有亲水涂层的输尿管支架管（美国 COOK公司）；术后留置支架管时间为4周，腹部X线检查提示支架管位置正常。

排除标准：尿液细菌培养阳性；肉眼血尿；腹部X线检查提示存在残留结石；凝血指标异常；严重的慢性基础疾病；有精神类疾病不能正常交流；拔管前1周内使用过抗菌药物。

本研究采用横断面研究方法，收集2018年10月至2019年3月山东省立第三医院（14例）、山东大学齐鲁医院（9例）、济南市中心医院（6例）和济南市济钢医院（6例）就诊的35例输尿管支架管置入术后患者。本研究经山东省第三医院医学伦理委员会审核（伦理审批文件编号：KYLL-2018003）。本研究临床试验注册号：ChiCTR1800020025。

二、研究方法

1.患者分组：所有患者拔除输尿管支架管当天留取晨尿中段尿，拔管前行腹部X线片、尿细菌培养、尿常规、血常规及凝血功能检查。然后拔除输尿管支架管。根据肉眼观察输尿管支架管管壁有无结壳，将患者尿液标本分为结壳组23例和非结壳组12例。结壳组的支架管管壁可见多处黄色结壳，以膀胱端为著（图1）；非结壳组的支架管管壁光滑，无明显结壳表现。

2.标本留取：用注射器将中段尿约100 ml、输尿管支架管冲洗液约50 ml经自制滤器过滤，收集每例患者的滤过膜，-80℃保存，后续用于菌群16S基因检测。自制滤器结构见图2，由两个类似瓶盖的部分嵌合而成，两个部分分别有进水口和出水口，两部分之间覆盖有滤过膜(针式过滤器，规格0.22 μm，美国 millipore公司)，可使尿液中的微生物附着在滤纸上。自制滤器使用前进行灭菌处理。

3.细菌DNA抽提和PCR扩增：微生物总DNA抽提按照E.Z.N.A. ®soil试剂盒（美国 Omega Bio-tek公司）说明书进行，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。用338F （5’-ACTCCTACG GGAGGCAGCAG-3’）和806R （5’-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3’）引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为95℃预变性3 min，27个循环（95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min。从2%的琼脂糖凝胶中提取所得的PCR产物，并使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒（美国 Axygen Biosciences公司）进一步纯化，使用QuantiFluorTM-ST（美国 Promega公司）进行定量检测。

4.Illumina Miseq测序：使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美国 Axygen Biosciences公司）进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST（美国 Promega公司）进行定量检测。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。构建文库步骤：①连接“Y”字形接头；②使用磁珠筛选去除接头自连片段；③利用PCR扩增进行文库模板的富集；④氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。

5.数据处理：原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接：①设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，去除质控后长度低于50 bp的序列；②barcode需精确匹配，引物允许2个碱基的错配，去除模糊碱基；③根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接，overlap需＞10 bp。去除无法拼接的序列。使用UPARSE version 7.1软件（http：//drive5.com/uparse/），根据97%的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/） 对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU132），设置比对阈值为70%。

三、统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件处理数据。所有数据以Mean±SD表示，组间比较采用t检验、χ2检验或Fisher精确概率。以P＜0.05为差异有统计学意义。在Majorbio Cloud Platform免费在线平台（www.majorbio.com）上进行有关细菌16s DNA测试的数据分析。

结果

一、一般资料

本研究共纳入35例患者，结壳组23例，非结壳组12例，两组分别因标本污染或PCR扩增失败退出15例和7例。最终本研究共有13例标本数据纳入统计分析，其中结壳组8例，无结壳组5例。两组的一般资料比较见表1，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

二、尿液菌群多样性特征

16s DNA检测结果显示，结壳组尿液中丰度占比＞1%的菌属数量为11个，丰度占比＞0.01%的菌属数量为74个；无结壳组尿液中丰度占比＞1%的菌属数量为7个，丰度占比＞0.01%的菌属数量为11个。两组的丰度占比＞1%的菌属数量差异有统计学意义（t=5.12，P=0.000）。结壳组中菌属丰度占比前3位的分别是乳杆菌属（23.1%）、拟杆菌属（18.8%）和未分级拟杆菌属（17.1%）；非结壳组中菌属丰度占比前3位的分别是埃希菌-志贺菌属（32.2%）、肠球菌属（24.9%）和假单胞菌属（18.2%）。在细菌菌属水平上，两组间差异最大的3种细菌是乳杆菌属（P=0.010）、拟杆菌属（P=0.004）和未分级拟杆菌属（P=0.004）。在细菌菌门水平上，两组之间差异最大的是拟杆菌门（P＜0.01）。

讨论

既往研究结果显示，支架管结壳的危险因素主要是尿路结石，而与尿液中钙离子水平以及支架管类型无关[7-8]。有关尿液细菌、支架管生物膜及支架管结壳三者关系的多项研究结果显示，尿液中的细菌是导致支架管生物膜形成的主要原因[9-11]，首先是尿液中的宿主蛋白附着在支架管上，提供了可以绑定尿液中细菌的位点，其后细菌与宿主蛋白结合，而细菌在支架管表面又合成了其他物质，最终促进了生物膜的形成[12-14]。能够分解尿素的脲酶阳性微生物则是支架管生物膜过渡到支架管结壳的重要关键因素，以奇异变形杆菌为例，这种细菌可以释放脲酶，脲酶催化尿素水解为氨和二氧化碳，引起尿液pH值升高，导致磷酸盐晶体沉积到管壁上[15]。在本研究中，奇异变性杆菌所在的变形菌门也是支架管留置患者尿液中丰度最高的前3个细菌菌门之一，这提示不管是哪组患者，如果不能及时拔除支架管，随着置管时间的延长，支架管结壳的发生概率及支架管梗阻程度都会逐渐增大。Kadihasanoglu等[16]的研究结果证实了支架管结壳等级与留置时间呈正相关。但是并非所有常见细菌均能非常容易地诱导支架管结壳形成，大肠杆菌虽然是引起泌尿道感染的常见病原菌，但是该细菌导致支架管结壳的能力要明显弱于奇异变形杆菌，可能的原因是：氨是大肠杆菌的重要生长因子，大肠杆菌通过氨转运通道AmtB吸收尿液中的氨离子，导致尿液中氨离子含量下降，削弱了支架管结壳的形成条件[15，17]。虽然也有学者认为支架管生物膜与结壳现象无关[8]，但是不能否认细菌与结壳现象之间的关系。由此可见支架管结壳的机制十分复杂，凡是能够影响尿液中钙离子、镁离子浓度以及pH值的因素都有可能与支架管结壳有关。需要特别说明的是，输尿管支架管拔除术作为一种清洁性操作，如果操作前尿液细菌培养为阴性，即便在拔管时发现支架管结壳，也不推荐术后常规使用抗菌药物预防泌尿道感染[18]。

健康人群的尿液并不是无菌的，通过16s DNA检测技术对健康人群尿液的检测结果显示棒状杆菌属常见于男性尿液中，女性尿液中则是乳杆菌属更常见，其他常见的细菌还包括拟杆菌属、放线菌属、肠杆菌属以及芽孢杆菌属等[19]。在机体免疫力下降、黏膜损伤、异物置入以及医源性操作等因素下，尿液中的菌群分布特点很可能会发生改变。本研究结果显示，与无结壳组相比，结壳组尿液中拟杆菌属的细菌丰度明显升高，这提示拟杆菌属细菌与支架管结壳存在相关性。我们认为其导致支架管结壳的机制可能有两个：①拟杆菌可以结合尿液中的钙离子。有文献报道，与其他细菌不同的是，拟杆菌属细菌的脂质A上的酰基转移酶LpxA含有3个钙离子结合位点，在碱基序列Asn89的调控下，能结合3个钙离子，且其中1个钙离子位于呈三重轴空间构象的LpxA的中心区域，但钙离子发挥的作用尚不明确[20]。②多数拟杆菌属细菌是脲酶阳性细菌[21]，利用其自身分解尿素的特点，可以导致患者尿液氨水平升高，甚至有文献报道出现高氨血症的尿路感染拟杆菌患者，较高的氨离子水平可促进尿液pH值升高，加快尿液中晶体的沉积和聚集[22]。

综上所述，支架管结壳患者尿液中细菌种类和数量都明显多于非支架管结壳患者，支架管结壳患者尿液中细菌种类中丰度较大的拟杆菌属细菌可能通过其结构功能以及脲酶阳性特性，促进了晶体在管壁上沉积。本研究结果扩大了我们对输尿管支架管结壳患者尿液菌种分布特点的认识，对尿液菌群分布的调控可能对预防支架管结壳产生积极影响。

参考文献（略）

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