Cell 子刊：复旦大学应天雷团队开发抗新冠全人源纳米抗体，可靶向新冠病毒受体结合区上的五类不同表位

生物世界

新冠病毒已导致全球数百万人感染，目前尚无针对其的特效药物。因此，亟需开发安全有效的抗病毒抗体，为抗击新冠病毒提供新型药物和治疗方案。

近日，复旦大学基础医学院应天雷团队在抗新冠抗体药物研发方面取得重要进展，发现了一系列抗新冠全人源纳米抗体，可靶向新冠病毒受体结合区上的五类不同表位。

该成果于5月14日以：Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2 为题，在 Cell 子刊 Cell Host & Microbe 杂志发表。

运用全人源纳米抗体技术成功筛选到靶向新冠病毒表面五类表位的高亲和力全人源纳米抗体

抗体是一种免疫球蛋白，传统抗体的单体呈“Y”字型，有4条多肽链组成，两条相同的重链（CH）和两条相同的轻链（CL），二者通过二硫键相连，若缺少轻链则重链可变区易发生聚合，而且其生产周期长，成本高，多被应用于治疗癌症和免疫性疾病，用于治疗病毒感染的单抗少之又少。

近年来，人们发现骆驼科动物存在一种天然的缺失轻链的重链抗体，其衍生出只含一个重链可变区（VHH）的单域抗体，也被称为纳米抗体（Nanobody），因其易于表达，可溶性高，尺寸小，抗原结合特性好和耐热稳定性高，逐渐受到制药行业青睐。然而，纳米抗体来源于骆驼或羊驼，即使人源化后仍然含有一定驼源成分，使得其人体使用存在安全性隐患。

抗体种类示意图

为了解决上述问题，研究团队近期与合作者基于合成生物学的理念开发了一种新技术，将全人源的重链可变区抗体骨架进行筛选重构，从而首次设计出基于天然胚系基因的全人源纳米抗体库；并以SARS-CoV-2的RBD结构域和S1蛋白为抗原，在抗体库中筛选出了靶向多类表位的纳米抗体；通过该方法首次揭示了RBD独特的免疫原性以及靶向S蛋白隐藏表位的中和抗体。

寻找可溶性人胚系免疫球蛋白重链可变区基因

基于对纳米抗体结构的了解，研究人员在国际免疫遗传学数据库IMGT中寻找与重链可变区抗体（中和HIV-1，且高度可溶和稳定）有相似骨架区的人胚系重链可变区基因，检索到17种人胚系的免疫球蛋白重链可变区基因，随后在大肠杆菌中分别进行克隆、表达、纯化，并与对照的驼源纳米抗体（VHH#3）一同进行了生物物理特性分析，结果发现3-66*01表现出最优特性。

开发全人源纳米抗体库

下一步，研究人员选用了胚系3-66*01抗体的骨架区（FR）序列作为支架，并移植了数个天然抗体库（来自健康成人捐献的血液）的重链互补决定区域CDR1、CDR2和CDR3（为抗体和抗原的结合位置，存在一定程度的序列变化）。因此，这种CDR移植可构建一个非常庞大且高度多样化的噬菌体展示纳米抗体库。

接着研究人员通过一组代表性抗原（包括病毒、细胞因子和免疫或肿瘤细胞表面抗原）的多轮淘筛，对上述抗体库进行了质量验证，均观察到有效的噬菌体富集，并呈皮摩尔/亚纳摩尔级的高亲和力，而且这些纳米抗体可在大肠杆菌中大量且可溶性表达。此外，它们的序列完全来源于人。

鉴定SARS-CoV-2特异性纳米抗体

首先，研究人员以SARS-CoV-2的受体结合结构域RBD为抗原进行了生物亲和筛选，获得了可显著富集的18种纳米抗体（A/B/C类），并对它们之间和ACE2（与RBD结合的细胞受体）与RBD的竞争结合能力进行了分析。

让研究人员惊讶的是，在SARS-CoV-2假病毒入侵实验中，这些抗体在50 mg/ml时都未显示出有效的中和作用，说明SARS-CoV-2 RBD的某些非中和性表位具有一定免疫原性。有意思的是，筛选出的n3010纳米抗体与RBD结合紧密，但不与S1蛋白（RBD结构位于S1内）结合，意味着它识别的表位在整个S1中处于隐藏状态。

其次，研究人员以S1蛋白作为抗原进行生物亲和淘筛，识别出了一些与RBD完全不同的抗体谱（A/B/D/E类）。不过大部分都能与S1和RBD结合，只有n3072与S1表现出了强力结合，同时不与RBD结合。

靶向S1的中和性抗体活性分析

研究人员分析了靶向S1的抗体中和活性：E类的n3086和n3113显示出中等强度的中和活性，能以剂量依赖性的方式抑制SARS-CoV-2假病毒侵染，其半抑制浓度IC50分别为26.6μg/ml 和18.9μg/ml；

D类的n3088和n3130的IC50分别为3.3μg/ml和3.7μg/ml，IC80分别为10.5μg/ml和11.5μg/ml；n3088或n3130与n3133混合后表现出协同效应中和SARS-CoV-2，IC50降到0.51μg/ml和0.70μg/ml，IC80低至3.2μg/ml和3.6μg/ml；且D类抗体中未观察到细胞病变效应，而活的SARS-CoV-2病毒和E类抗体中检测到明显的细胞病变效应。

特别值得关注的是，上述两株强效中和新冠病毒的全人源纳米抗体（n3088，n3130）靶向了病毒S蛋白三聚面上的一类特殊隐藏表位。

此前，团队在流感病毒研究中首次发现了这类特殊表位，并报道了靶向此表位的全人源单抗m826（Cell Host & Microbe，2017年10月刊封面文章），该抗体不能中和H7N9禽流感病毒，但可通过ADCC效应实现很强的体内保护效果。该研究后续被多个课题组验证，并报道了针对此表位的一系列流感抗体（Cell Host & Microbe, 2019; Cell, 2019a; Cell, 2019b）。

近期，团队又首次报道了可高效结合新冠病毒的全人源单抗CR3022（EMI, 2020），该抗体在后续研究中也被证实结合这类三聚面隐藏表位（Science, 2020）。CR3022是迄今为止发现的最广谱的冠状病毒单抗之一，提示该表位有可能成为新冠病毒的“阿喀琉斯之踵”，靶向该表位的全人源纳米抗体也可能具有较好的广谱性。

全人源纳米抗体由于具有更小的体积，相比单抗CR3022能更好的结合三聚面隐藏表位，因此具有更强的病毒中和能力。

综上，研究人员开发了一个用于快速分离人源纳米抗体的通用平台，并实战在了SARS-CoV-2抗体的筛选，尽管这些抗体的应用性还需进一步的研究，但来自人基因序列的抗体会更加安全有效；小尺寸和良好的生物物理特性也方便于纳米抗体的大规模、快速生产；可通过吸入方式进行高效递送和靶向治疗，理论上尤其适合用作新冠肺炎等呼吸系统疾病的治疗。

纳米抗体不仅可单独使用还能与其他抗体协同作用；小尺寸特征也成为了双特异性或多特异性抗体理想的构建模块，有效阻止病毒逃逸突变的出现等众多优点。因此，这些全人源纳米抗体有望开发成有效的防治药物，应用于新冠肺炎的临床救治。

复旦大学基础医学院抗体工程与新药研发课题组应天雷研究员为论文的通讯作者，吴艳玲博士为第一作者兼共同通讯作者，李澄博士生为第二作者。医学分子病毒学重点实验室姜世勃/陆路课题组、谢幼华课题组、张荣课题组等也对该工作做出重要贡献。

论文链接：

https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(20)30250-X#%20

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