当生长素浓度较低时,Aux/IAA抑制转录因子ARF(auxin response factors)活性;当生长素浓度达到一定水平,生长素受体TIR1 (transport inhibitor response 1)/AFB (auxin signalling F-box) 感知生长素后,促进Aux/IAA蛋白降解,激活ARF调控基因表达。ARFs可以分成3个家族:A-ARFs、B-ARFs和C-ARFs。通常认为A-ARFs是转录激活子,B-ARFs和C-ARFs是转录抑制子【1】,但不尽然。拟南芥包含6个TIR1/AFBs、29个Aux/IAAs和23个ARFs,构成多于4000个不同的互作组合,导致生长素响应系统基本的生化原则仍然不是很清楚。
近日,荷兰Dolf Weijers团队在Nature Plants在线发表了一篇题为Design principles of a minimal auxin response system的研究论文,以地钱(Marchantia polymorpha)为材料,揭示了MpARFs调控生长素响应的机制,可能代表最原始的生长素响应系统。此外,Nature Plants同期还发表了题为Barebones of auxin signalling的评述文章,对该研究行进了进一步的介绍。
由于地钱(Marchantia polymorpha)包含1个TIR1/AFBs、1个Aux/IAAs和3个ARFs(A/B/C),作者选用地钱研究基本的生长素响应架构。MpARF1突变导致明显的发育缺陷表型,MpARF2和MpARF3都不能互补Mparf1突变体表型,表明MpARF1-3功能是截然不同的。
ARFs包含一个DBD结构域(DNA-binding domain)、一个MR区域(middle region)和一个PB1结构域(Phox/Bem1 domain)。为了深入探究MpARFs功能差异的分子机制,作者构建了MpARF2和MpARF3的DBD、MR和PB1结构域分别替换MpARF1相应结构域的嵌合蛋白,并在Mparf1突变体背景下表达。MpARF211能恢复Mparf1突变体生长发育缺陷表型,而MpARF311不能互补,表明MpARF1和MpARF2可能结合相同的靶基因。DBD结构分析证实了这一点,MpARF1 DBD和MpARF2 DBD具有相似的DNA结合构造,而MpARF3 DBD一个重要的DNA结合的组氨酸突变成甘氨酸。转录组分析也表明MpARF1和MpARF3调控几乎完全不同基因表达。
MR区域通常决定ARF蛋白的转录活性【2】。MpARF121和MpARF131都不能互补Mparf1突变体表型,而且表现出更加严重的缺陷表型。此外,FLIM实验表明MpARF2通过MR区域招募转录共抑制子MpTPL。这些结果表明MpARF2和MpARF3主要作为转录抑制子行驶功能。
PB1结构域介导蛋白寡聚化,以及与抑制子Aux/IAAs蛋白互作【3】。缺失PB1结构域的MpARF110不能互补Mparf1突变体表型,而拟南芥LEAFY SAM寡聚化结构域替代MpARF1 PB1结构域(ARF11S)能部分互补Mparf1突变体表型,说明寡聚化对MpARF1功能至关重要。ARF112能部分互补Mparf1突变体表型,而ARF113不能互补。生物信息学分析(structural homology models)发现,与MpARF2和MpARF3不同,MpARF1不仅可以与MpIAA互作,还可以进一步聚合形成寡聚体,解析了MpARF1特异的生物学功能。
为了研究MpARF2拮抗MpARF1转录活性的生物学意义,作者通过同源重组和CRISPR-Cas9技术试图构建Mparf2突变体,但未能筛选到可遗传的纯合突变体。于是构建了Cre/loxP介导的环境依赖的基因敲除材料Mparf2cko。Cre诱导前,Mparf2cko叶状体(thalli)生长正常,而Cre诱导后,thallus tips生长受到严重抑制,表明MpARF2对MpARF1转录活性的拮抗作用对于地前叶状体的正常发育至关重要。为了进一步验证MpARF1和MpARF2的拮抗作用,作者通过FRET(fluorescence resonance energy transfer)实验表明MpARF1和MpARF2具有相似的靶基因结合活性,说明在蛋白量相似的情况下,MpARF1和MpARF2可以竞争结合调控靶基因表达。通过荧光定位发现,MpARF1广泛地在叶状体(thallus)中表达,而MpARF2主要在叶状体四周的边缘区域表达。MpARF1和MpARF1空间表达区域的不同决定了不同区域生长素响应基因表达和细胞生长素敏感程度,从而精细调控植物生长发育过程。
A/B-ARF antagonism defines a minimal auxin response model
综上所述,MpARF1(A-ARF)是唯一的生长素敏感的转录因子,生长素能解除Aux/IAA介导的MpARF1转录抑制活性。MpARF2(B-ARF)功能不依赖于生长素,可以与MpARF1竞争结合靶基因位点,抑制基因表达。解析MpARF2特异表达谱的调控机制将有助于揭示生长素调控植物发育的分子机制。此外,该研究发现MpARF3(C-ARF)似乎与生长素响应完全不相关,其功能有待进一步研究。
原文链接:
https://doi.org/10.1038/s41477-020-0662-y