干货：不同剂量荧光染料对外泌体标记效率的影响

gaobo 生物学霸

研究背景

外泌体荧光标记是外泌体功能研究中的必要技术，然而实际操作中对于使用多少外泌体、加入多少荧光染料、以及最终标记的效率是多少，这些问题都不明确，给操作人员带来不少困扰。

本研究目的为使用不同剂量荧光染料标记外泌体，通过纳米流式仪检测外泌体荧光效率以及染色后外泌体重新纯化后的荧光效率。

材料与仪器

1、细胞株：293T（ATCC, CRL-3216）

2、外泌体提取试剂盒（Umibio, UR52121）

3、纳米流式检测仪（NanoFCM, N30E）

4、相关试剂：

外泌体专用无血清培养基（Umibio，UR51102）
PKH67 绿色荧光标记染料（Umibio，UR52303）

实验方法

① 细胞培养

293T 细胞通过外泌体专用无血清培养基进行培养，收集细胞上清液，通过 0.45 μm 滤器过滤处理。

② 外泌体分离提取

通过 Umibio 细胞上清液外泌体提取试剂盒的说明书进行操作，提取的外泌体通过纳米流式检测仪进行颗粒浓度和 BCA 方法进行蛋白浓度测定。

③ 外泌体荧光染料标记

配制染料工作液：用 Diluent C 试剂（染色试剂盒自带）稀释染料储存液，配制浓度为 100 nM 的染料工作液 (PKH67)；
稀释染料工作液：按照 2 倍梯度通过 Diluent C 稀释 100 nM 的染料工作液；
向各实验组中加入 10 μL 对应浓度的染料，混匀后取 10 μL 进行纳米流式检测；
在标记的外泌体样品中补加入 1 mL 的 PBS, 使用试剂盒再次提取外泌体以去除游离染料；
沉淀用 100 μL PBS 重悬，再次进行纳米流式检测。

④ 外泌体荧光效率检测

纳米流式上机检测

实验结果

293T-Exosome 检测

Fig.1 外泌体电镜（A）和颗粒检测（B）

提取的外泌体通过 BCA 方法检测，外泌体总蛋白浓度为 0.882 mg/mL; 通过纳米流式仪检测颗粒浓度为 6.0E+10 particles/mL。

外泌体荧光染料标记分组

Group 1：Exosome（0 μg）+染料（100 nM，10 μL），染料终浓度：100 nM
Group 2：Exosome（10 μg）+ 染料（100 nM, 10 μL），染料终浓度：50 nM
Group 3：Exosome（10 μg）+ 染料（50 nM, 10 μL），染料终浓度：25 nM
Group 4：Exosome（10 μg）+ 染料（25 nM, 10 μL），染料终浓度：12.5 nM
Group 5：Exosome（10 μg）+ 染料（12.5 nM , 10 μL），染料终浓度：6.25 nM
Group 6：Exosome（10 μg）+ 染料（6.25 nM, 10 μL），染料终浓度：3.125 nM
Group 7：Exosome（10 μg）+ 染料（3.125 nM, 10 μL），染料终浓度：1.5625 nM
说明：以 ddH₂O 作为对照组校准基线。

外泌体荧光标记效率检测

3.1 染色后外泌体颗粒浓度变化趋势：

100 nM 纯染料组中未加入外泌体颗粒，其他各组中初始外泌体浓度为 3E+10 particles/mL，均为 20 μL 体系。

图 2 是染色后的外泌体的颗粒浓度变化曲线图，100nM 纯染料组中检测到 5.7E+10 particles/mL 的颗粒物，超出初始外泌体浓度，推测该颗粒为染料聚集物。50 nM 组中有 3.71E+10 particles/mL 的颗粒物，也高于初始外泌体浓度，推测该组中染料剂量过量，存在染料聚集物。

1.5625 nM 组和 3.125 nM 组中颗粒浓度小于 1E+10 particles/mL，推测染料中 Diluent C 稀释液对外泌体有一定的影响作用，可能会破坏外泌体。

Fig.2 染色后颗粒浓度（Particle/mL）

3.2 染色后荧光外泌体比例：

100 nM 和 50 nM 两个纯染料组中染料过量，荧光颗粒比例分别为 81% 和 71.2%，其他各组的荧光外泌体比例均在 35% 以下。

Fig.3 & 4 染色后荧光外泌体比例及趋势

3.3 重新提取后荧光外泌体比例：

通过针对染色的外泌体进行 2 次提取，以去除多余的染料，在染料过量组 100 nM 和 50 nM 组中，荧光比例由最初的 81% 和 71.2% 下降到 11.5% 和 23.3%；染料低剂量组中的荧光比例变化差异不是非常大，其中 25 nM 在前后两次检测时，荧光比例都在 30% 左右，相对稳定且荧光比例较高。

Fig.5 重提染色后荧光外泌体比例及趋势

实验结论

根据本次实验，可以得到一些初步结论：

① 在低剂量染料作用下（染料不过量时，25 nM 以内），在外泌体溶液中加入染料以及做二次提纯外泌体，外泌体的荧光比例变化不大（< 5%）；染料在此剂量范围内使用时，可以不用进行外泌体的二次提纯操作，减少外泌体的损失。

② 在高剂量染料作用下（染料过量时， 50 nM 以上），在外泌体溶液中加入染料以及做二次离心提纯外泌体，外泌体的荧光比例变化显著（> 40%）；染料在此剂量范围内使用时，必须进行外泌体的二次提纯操作，减少染料对于后期实验的影响。

③ 在本次测试中 25 nM 组，荧光效率较高，二次提取前后的变化不大，推荐染料使用浓度在 20~25 nM 之间。

❖ 补充数据：

外泌体与细胞共孵育实验：25 nM PKH67 标记 293T-Exosome 后，与 A549 细胞共孵育 2 小时后，进行共聚焦观察。

Fig.6 荧光外泌体共孵育检测

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参考文献：

1. Wenhao Dai, et al. Exosomes-mediated synthetic dicer substrates delivery for intracellular dicer imaging detection. 2019, Biosensors and Bioelectronics

2. Zhe Liu, et al. Monophosphoryl lipid A alleviated radiation‐induced testicular injury through TLR4‐dependent exosomes. 2020, JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR MEDICINE

3. Shin-ichiro Ohno, et al. Systemically Injected Exosomes Targeted to EGFR Deliver Antitumor MicroRNA to Breast Cancer Cells. 2012, The American Society of Gene & Cell Therapy

4. Hui Zhao, et al. Exosomes From Adipose-Derived Stem Cells Attenuate Adipose Inflammation and Obesity Through Polarizing M2 Macrophages and Beiging in White Adipose Tissue.2018,Diabetes

5. Ye Tian, et al. Protein Profiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry. 2018, ACS Nano

6. Peng Lv, et al. Genetically Engineered Cell Membrane Nanovesicles for Oncolytic Adenovirus Delivery: A Versatile Platform for Cancer Virotherapy. 2019, Nano Letters

文章来源：宇玫博生物

图片来源：宇玫博生物

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