中科院天津工业生物技术研究所朱敦明、吴洽庆研究团队：结构指导下羰基还原酶改造精准构建多手性中心化合物
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具有多个手性中心的酮醇、二醇是合成天然产物和药物分子的重要中间体，因此，它们的合成一直受到合成化学家们的高度重视，目前已经有各种不同的方法用来构建这些重要的分子。但是多手性中心的精准构建获得单一构型的这些手性分子仍然是合成化学的一大挑战。以2,2-双取代-1,3-二酮为底物，通过对羰基还原酶的定向进化实现了对底物羰基去对称化还原，技巧性地构建手性酮醇（单羰基还原，两个手性中心），进一步还原羰基可获得手性二醇（双羰基还原，三个手性中心），并且2位为手性季碳。最近，中国科学院天津工业生物技术研究所朱敦明、吴洽庆研究团队在该领域取得了重要进展（Nature Catalysis 2019, 2, 931-941；Organic Letters 2020, 22, 3444-3448）。
图1 2,2-双取代-1,3-环戊二酮的去对称性还原
（来源：Organic Letters）
2,2-双取代-1,3-环戊二酮的去对称性还原反应是合成多种甾体类化合物（13-位的手性季碳的形成）的关键步骤。以ethyl secodione为底物去对称性单羰基还原的产物是合成甾体类药物左炔诺孕酮（levonorgestrel）、孕二烯酮（gestodene）的关键中间体（图2a）；利用2-甲基-2-(3-氧代丙基)-1,3-环戊二酮为底物去对称化还原的产物可以用于合成13β-甲基-14β-羟基的甾体化合物（图2b）。2,2-双取代-1,3-环二酮的去对称化不仅可以用于合成甾体化合物的中间体，还可用于合成多种结构复杂的生物活性分子。
朱敦明、吴洽庆研究团队一直致力于将生物催化剂应用于药物分子和生物活性分子的手性中心高效构建。由于底物ethyl secodione去对称化后产物是合成药物如左炔诺孕酮（levonorgestrel）、孕二烯酮（gestodene）的关键中间体（图2a），具有极其重要的应用，课题组开展了对其的羰基不对称还原研究。首先根据对课题组羰基还原酶酶库筛选的结果，选择来源于Ralstonia sp.的羰基还原酶RasADH作为模板，通过Docking模拟，选择了酶活性中心与底物可能有相互作用的十个氨基酸残基作为改造位点（图3）。
图3 底物ethyl secodione在RasADH活性中心的Docking结果
（来源：Nature Catalysis）
采用手性醇逆向同时筛选活性和立体选择性的高通量筛选策略，经过数轮筛选，获得高效催化底物ethyl secodione的五突变体RasADH F12 (I91V/I187S/I188L/Q191N/F205A)。该突变体对目标底物ethyl secodione的活力提高了183倍，目标产物(13R,17S)-ethyl secol的比例由37.3%提高至>99.5%，该突变体具有较好的底物谱，能够应用于各种结构的2,2-双取代-1,3-环戊二酮的去对称性还原。通过解析五突变体RasADH F12与辅酶因子、手性产物的晶体结构和计算模拟分析，表明突变使得RasADH F12的α6螺旋的运动范围变小，能够更好地与底物进行结合，对产物的立体构型进行控制，从而取得了很好地催化效果（图4）。五突变体RasADH F12实现了2,2-双取代-3-羟基-环戊-1-酮还原获得(2R,3S)-构型产物的立体专一性制备，该成果发表于Nature Catalysis 2019, 2, 931-941。
图4 (a)野生型与突变体F12的结构重叠；(b)酶活性中心的盖子部分放大图；(c)突变体F12的酶活中心与产物(13R,17S)-ethyl secol的相互作用分析
（来源：Nature Catalysis）
与此同时，课题组开展了其他另外三种构型产物的手性制备。在之前羰基还原酶筛选的基础上，选择了来源于Sporobolomyces salmonicolor的羰基还原酶（SSCR）作为模板，首先进行了2-甲基-2-苄基-1,3-环戊二酮底物的Docking模拟（图5）。
图5 底物与羰基还原酶SSCR的Docking模拟结果
（来源：Organic Letters）
根据计算模拟结果选择了酶活中心可能与底物有相互作用的10个氨基酸残基，进行分组突变筛选。以2-甲基-2苄基-1,3-环戊二酮为底物，第一轮的筛选结果表明突变体T134I/V135I和P243F/Q245G还原底物的de值均大于99%（表1），尤其是突变体SSCR P243F/Q245G针对底物的活力相较于野生型提高了11.5倍。因此以SSCR P243F/Q245G为模板，对T134/V135文库进行筛选，获得了四突变体SSCR T134I/V135I/P243F/Q245G (M4)，该突变体在维持产物立体选择性不变的基础上，对底物的催化活力相较于野生型提高了23.9倍。
表1 羰基还原酶SSCR及其突变体的转化底物的结果
利用获得的SSCR突变体M4进行了底物谱的考察，发现突变体能够高效、高立体选择性的还原大部分的2,2-双取代-1,3-环戊二酮底物，结果如表2。
表2 突变体M4的底物谱
从表中可以看出突变体M4对于2-位具有较大基团（如取代苄基）的底物具有较好的还原结果，几乎生成唯一的(2S,3S)构型产物，该成果近日发表在Organic Letters, 2020, 22, 3444-3448。
在以上研究结果的基础上，利用实验室已有的羰基还原酶，开展了对一系列2-位为苄基或取代苄基的(2S,3S)-和(2R,3S)-酮醇的第二个羰基还原的研究， 初步实验结果显示，能够实现3个手性中心的精准构建，获得单一构型的2,2-双取代-1,3-环戊二醇。
发表在Nature Catalysis的文章，陈曦副研究员和张红榴助理研究员为论文共同第一作者，朱敦明研究员、吴洽庆研究员和西班牙University of Girona的Silvia Osuna教授为共同通讯作者；发表在Organic Letters的文章，研究生李娟为论文第一作者，陈曦副研究员，朱敦明研究员，吴洽庆研究员为共同通讯作者。上述研究工作得到了国家重点研发计划合成生物学重点专项、国家自然科学基金委和天津市科委的资助。
（DOI: 10.1038/s41929-019-0347-y）
（DOI: 10.1021/acs.orglett.0c00892）
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