纳米机器人具有作为响应分子触发的智能药物传递系统的潜力。利用DNA折纸技术,研究人员构造了一个自主DNA机器人用于运送有效载荷并将其呈现在肿瘤中。纳米机器人外部结合了DNA适配体,可结合了核仁蛋白(一种在肿瘤相关内皮细胞上特异表达的蛋白质)和其内腔中的凝血蛋白酶凝血酶。核苷靶向适配体既是一个靶向域,又是DNA纳米机器人机械打开的分子触发器。因此,体内的凝血酶暴露并激活肿瘤部位的凝血。利用荷瘤小鼠模型,研究者证明静脉注射DNA纳米机器人可将凝血酶特异性地传递到肿瘤相关血管,并诱发血管内血栓形成,导致肿瘤坏死和肿瘤生长抑制。
首先,研究者通过组装M13噬菌体基因组DNA链和多个短链,制备了尺寸为90nm×60nm×2nm的矩形DNA折纸。对于凝血酶负载,用poly-A序列捕获链延伸到每个DNA折纸纸表面的四个指定位置。我们合成了凝血酶-DNA结合物,通过交联剂磺基SMCC将硫代poly-T寡核苷酸连接到凝血酶分子上,并将其与DNA折纸混合,DNA上延伸的poly-A链能够与接合物上的poly-T杂交,从而使凝血酶分子锚定在DNA片的表面。
空心管状DNA纳米机器人直径约19nm,长度90nm,然后将装有凝血酶的DNA折纸固定在长边上,这四个凝血酶分子附着在管状纳米机器人的内表面,使其远离循环血小板和血浆纤维蛋白原。将DNA适配体(AS1411)所在的Y型结构与其杂交,将管状DNA纳米机器人沿着一定的接缝非共价闭合。通过AFM确认了DNA纳米机器人的闭合和打开状态(图1b)。折纸表面的四个亮点代表凝血酶货物产生的高度升高。
为了确定适配体所在Y型结构链与重组核仁蛋白或核仁蛋白阳性的血管内皮细胞HUVECs结合后是否能解离,研究者染料标记制备染料标记用作荧光信标。在识别重组体时核仁蛋白或在血管内皮细胞表面,Y型固件被激活产生高荧光强度。将标记的紧固件在HUVECs(图2b)上,荧光信号强度显著增加。作为比较,另外两个Y形结构(AS1411适配体互补双链或缺乏AS1411序列的对照组)未被HUVECs激活。当DNA纳米机器人处于“固定”状态时,FITC荧光被BHQ1淬火。打开后,DNA纳米机器人预计会产生较强的荧光强度增加。在这两种情况下都观察到重组核仁或核仁阳性的血管内皮细胞和荧光强度的实质性增加,表明纳米机器人已经打开(图2c、d)。
接下来研究了体外凝血来确定装有凝血酶的纳米机器人(Th)是否对目标蛋白有反应并暴露功能性凝血酶。当小鼠血浆与纳米机器人Th和HUVECs混合时,其凝结迅速,纤维蛋白形成时间为82s,而无细胞时为176s,单独细胞时为177s(图2e,f)。这种增强的凝血作用与无Y结构、凝血酶加载的DNA折纸片相当,表明细胞诱导的纳米管开放。此外,发现血浆凝固速率与加入Th的纳米机器人浓度之间存在正相关关系。这些数据表明DNA纳米机器人能够响应目标细胞改变其结构,并且暴露的凝血酶有效载荷可以诱导凝血。时间历程数据进一步揭示了这种纳米机器人与HUVECs的快速关联,最大结合时间在1h内,细胞表面停留时间至少为6h(图2g)
图2:DNA纳米机器人触发的激活和内皮细胞靶向分析
为了研究纳米机器人体内肿瘤血管靶向性,我们对荷原位肿瘤的小鼠进行荧光成像。纳米机器人在肿瘤中逐渐积累,注射后8h达到最大积累(图3a,b)。定量分析显示,靶向纳米机器人在注射后8h在肿瘤中的聚集效率是未靶向纳米机器人的7倍,表明能够在体内靶向肿瘤。为了进一步确定纳米机器人是否真的以阳性的肿瘤内皮细胞为靶点,标记后,对内皮细胞标记物CD34的肿瘤部位进行染色,结构显示纳米机器人有效地与肿瘤血管内皮细胞结合(图3c)。之后评估了肿瘤血管的靶向性以及治疗效果,证实此纳米机器人的效果。
图3:DNA纳米机器人在体内靶向肿瘤,诱导肿瘤血管血栓形成并抑制肿瘤生长
研究者之后研究了纳米机器人在较少血管化肿瘤中的抗肿瘤活性,数据表明基于可重构DNA纳米结构的靶向凝血酶传递系统在体内具有很好的抗肿瘤效果,适用于不同水平的血管化肿瘤,并且安全性较高。
1. 纳米机器人可用于将体内治疗性凝血酶智能输送至肿瘤相关血管,以引发高效的肿瘤血供阻断和肿瘤生长抑制。
2. 凝血酶递送DNA纳米机器人具有肿瘤靶向递送、肿瘤微环境信号识别、触发纳米结构变化和有效载荷暴露等优点。