PB：玉米气生根分泌物支持的高效生物固氮
黏液相关的固氮微生物群支持的一种玉米的固氮作用
Nitrogen fixation in a landrace of maize is supported by a mucilage-associated diazotrophic microbiota
PLOS BIOLOGY [IF:8.386]
DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2006352
发表日期：2018-08-07
第一作者：Allen Van Deynze1,Pablo Zamora1,Pierre-Marc Delaux2,Cristobal Heitmann1
通讯作者：Alan B. Bennett(abbennett@ucdavis.edu)1
合作作者：Dhileepkumar Jayaraman,Shanmugam Rajasekar,Danielle Graham,Junko Maeda,Donald Gibson, Kevin D. Schwartz,Alison M. Berry,Srijak Bhatnagar,Guillaume Jospin,Aaron Darling,Richard Jeannotte,Javier Lopez,Bart C. Weimer,Jonathan A. Eisen,Howard-Yana Shapiro,Jean-Michel Ane
主要单位：
1美国加州大学戴维斯分校植物科学系(Department of Plant Sciences, University of California, Davis, California, United States of America)
2美国威斯康辛大学麦迪逊分校农学系(Department of Agronomy, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin, United States of America)
写在前面
分享标题：玉米气生根分泌物支持的高效生物固氮
关键字：玉米气生根、粘液、固氮微生物、15N自然丰度法、宏基因组测序
点评：对于豆科植物来说，与固氮微生物的互利共生有助于其氮素营养的利用，但这些微生物在谷物中的作用却十分有限，包括玉米。如何显著提高生物固氮对非豆科植物的氮营养贡献一直是科学的前沿热点。加州大学戴维斯分校的杰出教授Alan Bennett课题组牵头撰文报道了一种固氮玉米，其拥有数量众多且分泌大量粘液的气生根。粘液具有低氧和富含糖的特性，该分泌物富集了大量固氮菌，表现出很强的固氮活性。经多种方法计算，该品种大气固氮对其氮素的贡献率达到29%-82%。在未来，确定这一性状的遗传基础、有关微生物固氮菌的识别和微生物的招募机制将是非常重要的。本研究和其他已发表的研究为研究玉米生物N2固定的潜在新机制提供了新的途径。这可能对玉米作物生产力和氮素利用效率产生重大影响。
摘要
植物与复杂的微生物群息息相关，其有助于营养获取、植物生长和植物防御。固氮微生物群在豆科植物中是高效的，并且具有很好的特性，但在包括玉米在内的谷类植物中的作用是有限的。我们研究了生长在墨西哥瓦哈卡的Sierra Mixe地区氮缺乏土壤中的土著玉米品种。这种陆生植物的特征是具有大量的气生根，它们分泌富含碳水化合物的粘液。对黏液菌群的分析表明，它富集了许多已知的固氮菌的类群，富集了编码固氮酶亚基的同源性基因，且拥有能被乙炔还原法和15N2掺入法测定的固氮酶活性。在Sierra Mixe的田间试验中，使用15N自然丰度法或5年的15N富集方法评估表明，大气固氮对Sierra Mixe玉米氮素营养的贡献率为29% ~ 82%。
作者总结
氮是植物必需的养分，对于许多非豆科作物来说，对氮的需求主要通过无机肥料的供应来满足。这些肥料是通过能源密集型过程从化石燃料中生产出来的，估计使用了全球总能源供应的1%到2%，并产生了等量的温室气体。因为玉米(Zea mays L.)是氮肥的重要接受者，几十年来的一个研究目标是确定或设计这种与作物有关的生物固定大气氮的机制。我们推测，在低氮营养条件下，使用传统方法种植的、很少施肥或不施肥的被筛选出的本地玉米品种可能已经进化出改善作物性能的策略。这里，我们展示了一种生长在墨西哥瓦哈卡附近缺氮田地里的玉米品种，其29%-82%的植物氮素来自大气氮。高水平的固氮能力得到了支持，至少在一定程度上是由于与气生根有关的富含糖的粘液大量的产出，其为复杂的固氮微生物群提供了一个家。
背景
植物生长与微生物群落密切相关，微生物群落影响着植物的营养获取、植物发育、植物防御和非生物胁迫反应等性状。植物根相关菌群的特征表明，其复杂程度远低于周围土壤的菌群，其中富含变形杆菌、拟杆菌和放线菌。这些微生物部分是由植物细胞壁特征和宿主细胞的代谢信号选择的。与27个现代玉米(Z. mays)自交系相关的根际微生物群落特征也表明，土体土壤和根际微生物类群的相对丰度存在显著差异，其中玉米基因型对根际选择性的影响虽小，但意义重大。
一个多世纪以来，与非豆科植物，尤其是谷类植物有关的固氮微生物一直是人们感兴趣的话题。在某些环境中，固氮内生菌有助于甘蔗的氮素营养，但在其他谷类作物中，有效的固氮类群证据较少。一项为期一年的基于Miscanthus × giganteus的15N稀释实验的研究表明，这种多年生生物能源的原料可以从空气中获得大约16%的氮。也有研究表明，模式谷物，狗尾草，以及粟(谷子)可以从与Azospirillum brasilense的组合中获得大量的固定氮。其他被转移到谷类的固定大气中N2的例子包括Azoarcus sp. 菌株 BH72和盐土草, Herbaspirillum seropedicae和水稻，以及Klebsiella pneumoniae和小麦之间的组合。由于其在经济上的重要性，寻找与玉米(Z. mays)关联的固氮类群一直是几十年来的“圣杯”，有几项研究考察了H. seropedicae
和Azospirillum sp.对不同玉米种质材料固氮的贡献。然而，在这些研究中，通常很难区分这些固氮菌对植物生长的促进作用，即从固定的氮到寄主植物的实际转移对产量的影响。评价固氮的常用技术有四种:乙炔还原测定(ARAs)法，15N自然丰度法,15N2气体富集法，以及氮平衡实验方法。所有这些方法都有潜在的缺陷，但是很少有研究比较这些不同的技术或进行多年评估以评估非豆科植物的固氮能力。
Triplett认为，通过调查来自玉米起源地区的原始玉米种来鉴定玉米固氮内生菌可能是很件有趣的事情。Estrada和他的同事根据这一建议，对墨西哥瓦哈卡Sierra Mixe地区的一种玉米进行了研究，并从本地玉米种中分离出固氮内生菌。该分离物被初步鉴定为Burkholderia的一个新种，但是大气氮源(N2)对植物氮的经济贡献还没有被测试。该研究组还报道了从田间种植的墨西哥类蜀黍植物中分离到一个类似的内生菌，并推测Burkholderia 可能与墨西哥类蜀黍形成了一种原始共生关系，这种共生关系在玉米驯化过程中一直存在。
我们还了解到，在瓦哈卡的Sierra Mixe地区，筛选出的本土玉米品种据报道是用很少或不施肥的传统方法来种植的，并推测这种独特的微生物群落组合（在种植的玉米中没有发现）可能已经进化。这种本土玉米品种的特点是具有能产生大量粘液的大量气生根。与玉米地下根系有关的黏液已在以前的研究中有所描述，表明根系分泌物在构建根际微生物群落中起着重要的作用。事实上，已有研究表明，豌豆根粘液可作为某些根际细菌的唯一碳源，包括Rhizobium sp., Burkholderia sp.,与Pseudomonas sp. 。玉米茎基部的气生根，也被称为支撑根或节状不定根，通常可以到达地面，被认为是防止倒伏的固定点，但也可能有助于养分和水分的吸收以及气体交换。然而，对于不落地的气生根及其产生的粘液所起的作用，人们知之甚少。在这里，我们证明了一个墨西哥玉米品种可以从空气中获取29%-82%的氮，并且至少有一部分氮是由存在于气生根粘液中的固氮细菌固定的。
结果
Sierra Mixe地区玉米的形态和粘液
Sierra Mixe maize morphology and mucilage
本地栽培的Sierra Mixe玉米品种如Rojo、Piedra Blanca和Llano，它们具有相似的植物形态，生长高度超过5米，每个节点上都有广泛的气生根形成。我们比较了Sierra Mixe玉米和另一种高大的玉米品种(Hickory King)的气生根的发育情况(图 1A)。与大多数现代玉米品种不同，在从幼体到成体的转变(箭头,图1A)之后气生根的形成就停止了，而Sierra Mixe玉米的气生根的形成在这种转变之后继续很好地进行，导致气生根的数量增加了3到4倍 (图 1B)。大约在发育中期(7月至9月)，当湿度适宜时，这些玉米气生根分泌大量的粘液，这些粘液富含阿拉伯糖、岩藻糖和半乳糖(图 2)。这些糖包含一种复杂的多糖，其可能有助于粘液的粘度，并可以被分解提供单糖来支持微生物生长和代谢。地下玉米根产生的粘液也含有大量的岩藻糖和阿拉伯糖，尽管浓度只有空气根粘液的一半。
图 1 Sierra Mixe玉米的生理特性
Physiological features of Sierra Mixe maize
(A) 在种植Sierra Mixe玉米(黑色条状图)和高大的heirloom Hickory King玉米(灰色条状图)5周后，幼龄期和成龄期之间的过渡(黑色箭头)。(B)在美国，麦迪逊的田间生长14周后，Sierra Mixe玉米和Hickory King玉米上观察到的气生根数量。误差线代表标准误差;星号表示Sierra Mixe玉米和Hickory King玉米至之间差异显著(Student t test, P < 0.01)。(Data at DOI: 10.6084/m9.figshare.
6534545).
图 2 气生根粘液
Aerial root mucilage
(A) Sierra Mixe玉米的气生根(左)在种植后3 - 6个月期间分泌大量的粘液。粘液富含碳水化合物，主要成分为阿拉伯糖、岩藻糖和半乳糖(侧幅)。
Sierra Mixe玉米的固氮菌群
通过对生长在Sierra Mixe地区的Sierra Mixe玉米进行16S rRNA基因的扩增和测序以及鸟枪宏基因组测序，研究了与其地下根和气生根、茎以及气生根黏液相关的微生物群。根际样品多样性最高，在植物样品中，气生根黏液多样性最高，其中拟杆菌和变形杆菌相对丰度高于植物的其他部分。许多在黏液中过量表达的世系包括已知的与植物相关的固氮菌。基于总群落组成的样本比较显示，黏液样本的聚类与其余的植物和根际样本在统计学上是不同的(图 3A)。基于序列变体的方差稳定丰度的样本聚类再次表明，虽然根际样本具有差异性和多样性，但粘液样本与其他植物组织差异更大。在Sierra Mixe玉米和土壤样品中被鉴定的所有序列变体的完整列表可在(DOI: 10.6084/
m9.figshare.4789759)中可以找到。此外，根据Dos Santos和同事的描述，对宏基因组数据进行了搜索，以寻找6个核心nif基因的同源性。这一研究揭示了所有6个核心nif基因存在于来自黏液和根际的宏基因组中，且只有6个核心nif基因的一个子集来自茎组织(图 3B)。粘液中大部分nif基因(nifD除外)的标准化丰度高于茎组织，说明粘液中可能富集有固氮微生物。
图 3 基于DNA序列的Sierra Mixe玉米的微生物区系特征
DNA sequencing–based characterization of the microbiome of Sierra Mixe maize
(A) 样本由基于Bray-Curtis相异距离的矩阵进行PCoA聚类。通过PCR扩增和rRNA基因测序对细菌群落进行评估。每个点对应一个单独的样本。在vegan包中通过跑adonis 的Permanova分析表明，黏液样品在统计学上是不同的(例如，粘液对根际P = 0.002，粘液对根P = 0.03，粘液对气生根P = 0.03)。(B) 基于宏基因组序列分析核心nif基因(nifH、nifD、nifE、nifK、nifN和nifB)和可选固氮酶(anfG/vnfG)的同源性。通过参考nif树的映射读长来查找宏基因组样本的同源性。hits数被标准化为宏基因组样本中细菌基因数量的估计值(使用the RecA hidden
Markov模型的hits次数来测量)。在黏液和根际文库中核心nif基因的最低丰度。*仅仅在茎的库中核心nif的hit。anfG和vnfG可选固氮酶仅在黏液库中被观察到。PCoA，主成分分析。
为了评估黏液中存在固氮微生物群落的可能性，用ARAs法和加入15N2气体法检测粘液的固氮酶活性。ARA被用来评估生长在墨西哥或美国麦迪逊的Sierra Mixe玉米植株上采集的叶、茎、地下根、气生根(含或不含粘液)和粘液。分泌粘液前，地下根、叶、茎、甚至气生根均未被检测到ARA活性。相反，在含有粘液的气生根和生长在Sierra Mixe或Madison地区植物的分离粘液中检测到显著的ARA活性(图 4A)。
从生长在麦迪逊的Sierra Mixe玉米中分离出的黏液的ARA活性表明，要么Sierra Mixe玉米种子携带一种内源性的固氮细菌，要么Sierra Mixe玉米可以从当地环境中招募足够的固氮细菌。通过将15N2直接掺入收集自Sierra Mixe玉米的黏液样品中，测定了黏液样品的固氮效果(图 4B)。
图 4 Sierra Mixe玉米黏液中固氮酶和N2固定的活性
Nitrogenase and N2 fixation activity in mucilage produced by Sierra Mixe maize
(A) 从美国麦迪逊的Sierra Mixe地区或田间种植的植物中收集的各种Sierra Mixe玉米株系和墨西哥类蜀黍的黏液显示出很强的乙炔还原活性。(-,没有乙炔;+,10%乙炔)。星号表示差异显著( P < 0.05;
** P < 0.01, Mann-Whitney test)。(B)通过同化15N2表征的Sierra Mixe玉米黏液中的固氮作用。从生长在Sierra Mixe地区的Sierra Mixe玉米中收集的粘液，在37℃、充满15N2或14N2气体的气密瓶中孵育70小时。用IRMS法测定15N(过剩的原子%)。(C和D)当H.seropedicae和A. brasilense*被加入不固定的粘液中表现出乙炔还原活性，而在相同的添加了无菌培养基(-)粘液中或相同的没有粘液的细菌(-)则没有。(E) 粘液内8毫米处的氧浓度。显示了平均值和标准误差。不同的字母表示差异显著(KruskalWallis test)。(Data at DOI: 10.6084/m9.figshare.6534545)。IRMS，同位素比质谱法。
和Sierra Mixe玉米一样，一种野生近亲，Z. mays ssp. mexicana（墨西哥类蜀黍） 也产生广泛的气生根，但分泌的粘液量少得多。为了测试墨西哥类蜀黍黏液支持固氮的能力，我们采集了几种墨西哥类蜀黍植株的黏液，并用ARA测定了内源固氮酶活性。在墨西哥类蜀黍粘液中容易观察到乙炔还原活性(图 4A)，表明通过相关的固氮微生物群来支持固氮的粘液的产生可能是玉米的一种古老的特性，并可能在驯化后有从Z. mays ssp. mexicana 到Sierra Mixe landrace玉米种的基因渗入。
为了评估支持固氮的粘液特性，我们测试了两种系统发育上不同的固氮细菌在接种于收集自Sierra Mixe玉米气生根的粘液中还原乙炔的能力。实验前，将黏液在-80度冻结2周后解冻，以消除内源固氮酶活性(图4C)。两种固氮细菌，H. seropedicae和A.brasilense，在加入到粘液中时，很容易检测到ARA的活性(图4C和4D)。细菌固氮酶对O2敏感，需要低氧(<5%)环境或生理保护机制的保护，同时需要丰富的碳源为这一过程提供能量。为了确定粘液是否能满足这些要求，我们测量了Sierra Mixe玉米和墨西哥类蜀黍在深度为8mm时粘液中的游离氧浓度，发现其小于5%，说明粘胶液可以为这些细菌提供一个与固氮兼容的微需氧环境(图 4D)。黏液也由复杂的糖分组成，可被分解产生游离糖，主要是阿拉伯糖、岩藻糖和半乳糖，可支持细菌生长和固氮。为了确定黏液的这些特性是否足以支持固氮，我们创建了一个模仿这些粘液特性的人工培养基，其使用一个低氮培养基,用0.2%的琼脂固化,且使氧浓度减少到几乎与粘液中一样低的水平并补充一致与充分水解粘液碳水化合物的组成的混合游离糖。H. seropedicae, A. brasilense, 和
Burkholderia unamae在重建的粘液中显示出明显的ARA活性，表明气生根粘液提供的低氧和游离糖足以支持这些固氮菌固氮。
根据ARA，我们可以得出结论，来自Sierra Mixe玉米的粘液中含有原生的固氮菌，且也可以支持外源接种的固氮菌H. seropedicae、A. brasilense和B. unamae的固氮活性。然而，这些数据并不能证明气生根具有摄入和同化被固定的氮的能力。为了测试黏液相关固氮菌固定的大气N2是否能被Sierra Mixe玉米转移和利用，我们进行了更直接的15N2气体富集实验。与经14N2气体处理的根相比，接种了A. brasilense Sp7 的气生根及其产生的粘液表现出显著的15N2气体的融入(图 5)，同位素比质谱(IRMS)分析证实，与阴性对照相比，这些根的叶绿素(转化为脱镁叶绿素进行分析)显著富集了15N(图 5)。
图 5 Sierra Mixe玉米样品中15N2在粘液、气生根和来自气生根的脱镁叶绿素中富集的分析
Analysis of Sierra Mixe maize samples for 15N2 enrichment in mucilage, aerial roots, and pheophytin from aerial roots
(A) 粘液从气生根中产生，并接种A. brasilense Sp7。注入15N2气体，在孵化粘液后，从气生根中分离。分别对粘液和气生根进行单独IRMS分析。结果显示，15N2在单独的粘液和单独的气生根中显著富集(左y轴)。由于接种的气生根表面可能含有A. brasilense Sp7，我们从这些气生根中提取了脱镁叶绿素，并测试了15N2在脱镁叶绿素中的掺入。结果显示，这些气生根中有15N2的显著富集，说明气生根确实是植物将固定的氮传递给植物的场所(右y轴)。14N2样品做阴性对照。n = 4(气生根和粘液)，n = 3(脱镁叶绿素)。星号(*) 表示具有统计学上显著的差异p < 0.05)。(Data at DOI: 10.6084/m9.figshare.6534545) IRMS，同位素比质谱法。
固氮促进玉米氮素营养
Nitrogen fixation contributes to maize N nutrition
15N2从黏液转移到气生根组织和叶绿素，表明了这种固氮群落对植物氮营养的贡献潜力，但本研究的一个主要问题是，在田间条件下，黏液相关的固氮菌群是否能够转移固定的氮，至少部分满足Sierra Mixe玉米的减少的氮需求。利用自然丰度15N测定法，首次在田间估算了大气固氮对Sierra Mixe玉米的贡献。这种方法依赖于大气和土壤中稳定同位素15N的相对丰度，土壤中的15N丰度比空气中的丰富。因此，与参考非固定氮素的植物相比，从大气中吸收N的植物显示出降低的δ15N水平。2006年，收集了来自两块田的相邻生长的菊科和毛茛科(没有已知固氮成员的科)的Sierra Mixe玉米和参考植物样本。在这个初步实验中，Sierra Mixe玉米δ15N明显低于参考植物,表明大气中氮的同化。在2010年、2011年和2012年，通过对生长在Sierra Mixe玉米植株附近的非固氮植物和传统玉米品种Maiz Blanco Conasupo的参考种进行采样，这些方法被用于Sierra Mixe的实验。除了确定来自每个玉米和参考植物样本的δ15N，每个参考植物的叶样品被用于18srRNA序列分析以确定参考品种 (表 1A)。生长在 Sierra Mixe地区田间的Sierra Mixe玉米的δ15N值在2010年以一个单独的发展时间点，在2011与2012年以5个发展的时间点被确定。2010年,Sierra Mixe玉米的δ15N值明显低于参考植物物种和传统的玉米品种（Maiz Blanco Conasupo）(表 1A)，说明Sierra Mixe玉米组织中的氮素有很大一部分来自于大气中的氮素。根和叶样本类似的δ15N值也表明,分析叶样品能代表整个植物。在2011年和2012年,Sierra Mixe玉米的δ15N值明显低于在第4、5发育时间点的参考植物，表明Sierra Mixe玉米部分组织中的氮素来自于大气氮素(表 1B)。来源于表1中δ15N值介于30%和80%之间的获得于大气中的氮的计算百分比(%Ndfa)。
表 1 自然丰度15N的测定
Natural abundance 15N determinations
(A) 在种植三个月后Sierra Mixe玉米、传统玉米品种(Maiz Blanco Conasupo)以及生长在Sierra Mixe地区的参考植物的δ15N值。数值以平均值和标准差表示。参考植物，Maiz Blanco Conasupo和Z. mays S. Mixe的平均值使用学生t检验 (p < 0.05)进行了统计比较。不同的字母表示差异显著。(B) 在2011年和2012年间，种植于Sierra Mixe地区田块1、2的Sierra Mixe玉米植株在种植后第2，3，4，5，6个月的δ15N值。数值以平均值和标准差表示。利用学生t检验(p < 0.05)，对各时间点的参考植物平均值与Z. mays S. Mixe平均值进行了统计比较。不同的字母表示统计差异显著。参考植物列在表S3中。(Data at DOI: 10.6084/m9.figshare.6534545)。
由于参考植物和试验植物的根和茎生长的差异和物候现象的差异以及在土壤中发现的δ15N范围有限，因此使用自然丰度15N和其他物种作为参考植物来计算％Ndfa的方法可能受到限制。另一种方法，15N富集,是类似于自然丰度方法，但是通过添加15N肥料使土壤富集15N,从而增加土壤和大气之间δ15N的差异和检测灵敏度。几次直接比较表明，这两种方法的结果可以比较，但略有不同。
另一种估算N2固定的方法是N差异法，它决定了一个固氮植物的总N含量与一个参考非固氮植物的总N含量的差值。总氮是用特定植物样本中总氮含量(%)与植物产生的总生物量(kg/ha或kg)的乘积来计算的。%Ndiff的计算方法如材料和方法中所述。
在2016年和2017年，在3个低氮ierra Mixe田中的完全随机区组设计(5个重复)中我们采用15N同位素富集方法（1％-10％富集）在3个营养生长期V9，V12和抽穗期上评估大气固氮，并在2017年的抽穗期在相同的田块采用相同设计(表 2)。在2016年，田块3仅在抽穗期SM2的 Atom% 15N产生显著的差异，而发芽期的N在2016年和2017年都有显著差异。2016年，4号田的Sierra Mixe玉米品种在(玉米生产历史为1 - 2年)抽穗期和V9期的Atom%15N水平显著低于对照植株，==and at Tassel in both years for shoot N==。2016年和2017年，5号田(玉米连续种植3年以上)的Sierra Mixe玉米各品种在各采样阶段的Atom%15N和==shoot N==含量均显著降低，说明这些试验中存在显著的大气固氮水平。计算得到的Ndfa %在31% ~ 55%之间，Ndiff在29% ~ 82%之间。Ndiff与Ndfa在2016年和2017年的相关系数分别为0.55和0.44 (P < 0.01)。氮固定的有效的方法是由6个Atom%15N N测定实验(Ndfa)中的4个及6个Ndiff 测定实验中的6个测定的。对照杂种和地方品种在根和芽的生物量、高度和茎粗之间存在显著差异。土壤分析显示，所有地点的土壤氮均已耗尽，但作物产量仍超过2000公斤/公顷。三块田的不同轮作阶段(玉米连续生产0 ~ >4年)的微生物群的差异可能是导致田间和年际差异的原因，但要回答这个问题还需要进一步的研究。
讨论
我们已经证明，与Sierra Mixe玉米气生根相关的黏液可以支持一个复杂的固氮菌群，该菌群富含编码固氮酶亚基的基因同源物，这些基因亚基具有活跃的固氮酶活性，氮能有效地从固氮细菌转移到寄主植物组织中。总的来说，经过数年和不同的地点，一个Sierra Mixe本地玉米品种的2个选择的15N自然丰度和15N富集结果表明，在当地环境中生长时，其氮素营养可以通过固定大气中的氮得以部分满足。固氮是一种特别难以评估的表型，因为所有可用的技术都容易产生人为因素，并能给出不同的固氮估计。在这项研究中，我们对Sierra Mixe玉米使用了几种经典技术，并在多个地点和多年的研究中证明，Sierra Mixe玉米能够以我们所知的以前从未在玉米中报道过的速率(29%-82%)固定氮。
本研究还揭示了气生根及其产生的粘液在防止倒伏和吸水之外的一种新的重要功能。对于不触及地面的气生根来说，这种固氮的作用可能是其最重要的一个作用。探索高粱等其他谷物产生的气生根是否也有类似的功能，将是一件有趣的事情。我们不能排除Sierra Mixe玉米其他部分的固氮活性也可能有助于从大气中获得还原态的氮。在气生根广泛发育之前，在Sierra Mixe玉米植株中出现的固定大气N2的发育时间表明，可能确实存在更多的固氮位点。然而，在气生根粘液的外面,我们没有检测到任何显著的氮酶活性。
该性状的遗传基础或微生物接种的来源，可能是环境或种子传播的，尚未得到解决。我们观察到的一种墨西哥类蜀黍品种(Z. mays ssp. mexicana) 在其气生根相关黏液中也表现出类似的固氮活性，表明，这是一个古老的特征，可能已经渗入和扩大到了Sierra Mixe品种。在未来，确定这一性状的遗传基础、有关微生物固氮菌的识别和微生物的招募机制将是非常重要的。本研究和其他已发表的研究为研究玉米生物N2固定的潜在新机制提供了新的途径。这可能对玉米作物生产力和氮利用效率产生重大影响，特别是在世界上农业土壤营养不良的地区。
材料与方法
Materials and Methods
种植物料
Plant material
Sierra Mixe玉米种子来自墨西哥瓦哈卡的Sierra Mixe地区，来自开放授粉的种群。Z. mays ssp. mexicana (墨西哥类蜀黍), LH123HT, Mo17, PHG39, LH82,
PH207, 以及B73种子来源于美国农业部国家植物种质系统(NPGS)(登录号分别为:8083、PI601079、PI558532、PI600981、PI601170、PI601005、PI550473)。玉米line Hickory King从Victory Seeds获得（登录号 3140041）。Tornado-F21 and H-377 来自瓦哈卡的Semillas Ceres。SM1和SM2是来自Sierra Mixe 品种的不同的选择。SM1是基于内核大小、形状和颜色的均匀种群，而SM2是一个代表当地品种的异质群体。
生物材料是根据Sierra Mixe团体和BioN2公司之间的准入和利益共享协议而获取和使用的，并得到了墨西哥政府的许可。已经针对此类活动签发了国际认可的《名古屋议定书》规定的遵守证书（ABSCH-IRCC-MX-207343-3）。
菌株和培养基
Bacterial strains and media
A. brasilense Sp7和B. unamae MTI-641分别由G. Alexandre博士(美国田纳西州大学诺克斯维尔分校)和A. Hirsch博士(美国加州大学洛杉矶分校分校)提供。H. seropedicae Z152 (ATCC 35894)由ATCC( http://www.atcc.org/ )提供。细菌被培养在液体BSE培养基中。
样品收集
Sample collection
分别于2010年、2011年和2012年对Sierra Mixe地区田块1、2中的Sierra Mixe玉米的根际和植物组织(包括茎、叶、气生根、地下根和粘液)进行取样。对于植物内生菌分析，用mqH2O漂洗组织进行表面消毒，用70%乙醇轻轻摇5分钟，放入1%次氯酸漂白剂中，轻轻搅拌10分钟，用mqH20漂洗3次，在层流箱内干燥。根和茎在提取之前也被解剖，以去除表皮组织。为了进行种子内生菌的分析，我们将Sierra Mixe、Hickory King和B73的胚和胚乳在层流箱内用剃须刀片手工从种子中取出，收集在1.5 ml无菌微离心管中。在这项研究中，根际被定义为覆盖在根系外表面的一层土壤，可以用缓冲/清洁剂溶液从根系中清洗出来。首先将根系分开并摇动以去除松散的土壤。所有土壤和植物材料样本立即用于DNA提取。土壤肥力分析包括土壤物理参数、土壤反应和土壤盐分在AgroLab实验室(Pachuma, Mexico)进行。
植物表型分析
Plant phenotyping
每周(温室)或14周后(田间)监测有气生根节点的数量。14周后测定气生根总数。每周监测叶蜡的消失和毛状体的出现，以确定Sierra Mixe和Hickory King 玉米幼体和成体的过渡时期。
温室和田间试验（美国麦迪逊）
Greenhouse and field experiments, Madison, USA
对于温室中的实验，将1、2号田的Sierra Mixe种子以及Hickory King种子表面消毒进行如之前所述的发芽试验。1周后，幼苗被移栽到40升的花盆中，花盆中填满沙子和珍珠岩(v:v)，然后置于生物气候室(美国威斯康星大学麦迪逊分校)的高天花板温室中生长。每天给植物浇两次强度为霍格兰溶液一半的水溶液，每次2分钟。为了进行田间试验，种植了每个基因型20个植物的3个独立地块，每个基因型之间有3个边界行（B73）。生长在
Madison的被用于ARA检测的Sierra Mixe and Teosinte植株被同时种植在同一田地上。本试验在3个不同的田间小区进行了重复。
粘液糖基的组成
Mucilage glycosyl composition
采用气相色谱-质谱联用技术(GC/MS)对由样品经酸性甲醇分解得到的单糖甲基苷的邻三甲基硅(TMS)衍生物进行糖基组成分析。首先从在1 M HCl甲醇中经80 ˚C
(18–22 hours)条件下乙酰化的干燥粘液样品中制备甲基糖苷，然后在甲醇中与吡啶和乙酸酐进行re-N-乙酰化反应(对于检测氨基糖)。然后在80度(0.5小时)高温下，用trio - sil (Pierce)对样品进行per- o -三甲基硅化反应处理。在连接5975b MSD的HP 6890 GC上采用一根All Tech EC-1熔融石英毛细管柱(30 m×0.25 mm ID)进行甲基糖苷的GC/MS分析。该分析是在美国雅典乔治亚大学复杂碳水化合物中心(CCRC)进行的。
DAN的提取
DNA extraction
使用DNA提取试剂盒(Mo Bio Laboratories, Carlsbad, USA)从100毫克的根际植物组织中提取DNA(80–150 ng μl−1)。对16S rRNA基因进行微生物DNA分离的PCR对照。用真菌引物27F (50-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-30)和1492R (50-GGTTACCTTGTTACGACTT-
30)进行PCR，产物是一个大约1450个bp片段。使用正反引物各1μM，3mM MgCl2，每一种dNTP各20 μM，1.25单位的聚合酶(Promega)与1X的反应缓冲液(Promega, Madison, USA)混合成20 μl 的体系。PCR条件为95 ˚C 预变性3分钟，之后在94 ˚C变性1分钟，56 ˚C退火一分钟，72 ˚C延伸1.5分钟的条件下进行35个循环，最终再进行72 ˚C延伸7分钟。在100 V下运行30分钟的琼脂糖凝胶电泳解析DNA，分别用于分析总DNA和扩增PCR产物。在凝胶记录系统中，用溴化乙锭染色在紫外线下观察凝胶。
基于illumina的16S rRNA基因测序
Illumina-based 16S rRNA gene sequencing
采用Caporaso方法对根际和植物组织进行16S rRNA基因PCR和测序。我们将Caporaso方法扩展到每个样本双条形码的方案，并将Golay条形码替换为一组不同的与illumina兼容的条形码，这些条形码的设计目的是平衡碱基组成和容忍条形码序列中最多4个排序错误。所使用的前置引物为AATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACAC[Barcode]TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA, 反向引物为CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[Barcode]AGTCAGTCAGCCGGACTA
CHVGGGTWTCTAAT。所使用的条形码被设计成允许在一次MiSeq运行中汇集多个样本。在退火温度(55˚C)下进行10次条形码引物PCR;然后使用Qiagen柱收集和清洁样品，以去除未合并的引物。在这一阶段，我们使用Illumina双端的flowcell引物在较高的退火温度(65 ˚C)条件下进行了10或20个循环的PCR反应。所得的PCR产物用Agilent Bioanalyzer 进行QC，使用 KAPA Biosystems qPCR试剂盒估计其浓度。样品被稀释到MiSeq运行所需合适的装载浓度，加入25%的phiX控制库，使用制造商标准的150个核苷酸双端双指标测序协议和定制的测序引物，通过Illumina MiSeq仪器进行测序。
Illumina序列来自2次MiSeq测试(2X150 bp双端)，并使用自定义脚本进行多路解析(https://figshare.com/s/04997ae7f7d18b53174a)。如此获得的822,804个读长被修剪成phred-等效的20，然后使用BBDuk过滤掉接头污染(工具包 https://sourceforge.net/projects/bbmap/)。由于反向配对的质量较差，因此在分析中使用了正向配对的读长。然后使用DADA2对读长进行预处理和分析。使用了规定的标准过滤参数，如PhiX污染检查和去除有两个以上错误的或有模糊碱基或预期错误大于2的读长。利用DADA2的removebimenovo功能识别并去除嵌合体。然后利用RDP训练集将干净的读长分解为序列变量并进行分类(version14)。被归类为叶绿体或线粒体的序列变体被从进一步的分析中去除。从大小范围为84到20597读长(平均4703)的文库样本中，识别出995个独特的序列变体。
Alpha和Beta多样性指标是使用Phyloseq 3.4.2 R包生成的。利用Shannon和Simpson指数计算Alpha多样性。此外，使用基于Bray-Curtis差异矩阵的PCoA图来可视化样本间的差异。在DESeq2中，通过在DESeq2中进行稳定变量转换之后，序列变量表被用于生成一个热图。使用vegan 3.4.3.R程序包(https://CRAN.R-project.org/package=vegan) 中的adonis功能进行置换检验来执行NMDS排序。
宏基因组测序
Metagenomic sequencing
采用一种自适应的基于Nextera转座酶的文库构建方法，采用多重条形码技术，从上述相同的DNA提取中获得Illumina测序文库。然后在MiSeq和HiSeq仪器上对样品进行测序。如此获得的Illumina序列使用Trimmomatic (ver 0.33)进行解析和裁剪，参数如下：Illuminaclip 2:30:10, Headcrop:15, Leading:20, Trailing:20, Sliding window:4:20, and Minlen:100. 然后使用针对PhiX基因组(Genbank acc# NC_001422.1)和Z. mays 栽培品种B73草图基因组(RefSeq assembly acc#
GCF_000005005.2)的Bowtie2比对器，针对PhiX和玉米序列(基因组、叶绿体和线粒体)筛选读长。利用含有nr数据库的Kaiju方法对干净读长进行分类。为了计算样本的beta多样性，我们使用了Phylosift (ver 1.0.1)，它识别并定位了匹配到参考树上的37个保守系统发育标记基因的读长。从这些位置，使用Guppy进行了Edge-PCA分析。
Nif 基因搜索
Nif gene search
我们从GenPept中检索了以前发表的已知固氮菌的6个核心nif基因(nifH、nifD、nifE、nifK、nifN、nifB)和备择固氮酶(anfG、vnfG)的肽序列作为参考。使用ClustalW2生成这些序列的多序列比对作为参考比对。针对这些参考序列进行了6个框架翻译的宏基因组读长的blast搜索。然后使用clustal-Omega根据参考的多序列比对对 hits 进行比对，然后使用具有氨基酸进化和gamma20似然的WAG模型的Fasttree2.1为每个nif基因生成系统发育树。如果这些读长在参考序列的分支内，则被认为属于nif基因。每一个与核心nif基因有显著相似性的读长，通过系统发育被进一步分析以确定其为6个核心nif基因之一。通过recA计数将获得的nif基因的数量标准化。
乙炔还原法ARA
Acetylene Reduction Assay ARA
对于黏液的ARA，从1或2个气生根Sierra
Mixe) 或生长在田间的几种植物（墨西哥类蜀黍）上收集新鲜的2毫升黏液，将其装入14.5毫升的小瓶(Wheaton, Millville, USA)中，并紧紧封闭。对于添加了细菌的ARA，A. brasilense、H. seropedicae和B. unamae在BSE培养基中被培养48小时。然后通过离心(5min, 4000×g)收集细菌并重悬在Fahraeus培养基中。将最终OD600nm = 0.01的菌悬液接种到14.5 ml的小瓶中，每个小瓶装有5ml的黏液，被预先在-20℃下数月以减少内源性固氮细菌。
对照管为不含细菌或用5ml Fahraeus培养基代替粘液而制备。然后,将850μl乙炔(气体)注入每个瓶。72小时后测量每管OD600nm。对于这两种情况，不含乙炔的对照组同时进行。对于有气生根的ARA，每14.5 ml瓶中加入1根无粘液的气生根(10个重复)。每小瓶注射一毫升乙炔(气体)。对于小苗的ARA，Sierra Mixe小苗被接种A. brasilense，培养3周。然后将植物转移到500毫升的罐中，每个罐中注入50毫升乙炔。对于有地下根的ARA，从盆栽植物中收集根(约10厘米长)，放入14.5 ml的瓶中（三个重复）。乙烯的定量是通过注射1毫升的空气相（72小时后采样）到配有Rt-Alumina BOND/
KCL柱(Restek)的气相色谱上(GC-2010 Shimadzu)。
粘液对15N2的吸收
Mucilage 15N2 assimilation
15N原子在黏液中的富集是通过将4ml的顶空气体移出并用4ml的15N2 (Sigma-Aldrich)或14N2氮气直接注入含有1.0 ml黏液的小瓶中来实现的。从生长在Sierra Mixe地区的Sierra Mixe玉米植株上采集粘液，在取样至测定15N2的同化之间，保存于4˚C 条件下2周。黏液样品在有15N2存在的条件下于37℃孵育0和70小时。通过将黏液样品在−20˚C条件下冷冻使其对15N2地同化停止。然后将样品冷冻干燥并称重。黏液样品的15N2分析是在UC Davis稳定同位素设备(Davis, USA)和UW-Madison土壤科学设备 (Madison, USA)进行的。使用SYSTAT地第10版本进行统计分析(Chicago, USA)。
自由氧浓度的测量
Measurement of free-oxygen concentration
对于收集的粘液的测量，在15毫升的试管中注入2毫升粘液。探针(鲁棒氧微探针，Pyroscience)被引入8毫米深的粘液进行氧的测量，直到稳定的信号被观察到。对照对应的是液体Fahraeus培养基中的自由氧浓度。根据制造商的建议，在曝气的水中进行了一点校准。
15N2富集实验
15N2 gas–enrichment experiments
气生根是从生长在Biotron温室设施的Sierra Mixe玉米中采集的(University of Wisconsin, Madison, USA)。这些气生根在室温下5ml水中培养48小时，产生粘液。粘液与气生根一起，被接种A. brasilense Sp7。然后，将10%-15% (v/v)地15N2气注入小瓶，30℃孵育48小时。在单独培养粘液或单独培养气生根后，对从这些气生根中提取的脱镁叶绿素进行IRMS分析。为了获得脱镁叶绿素，从气生根中提取叶绿素，经酸性处理转化为脱镁叶绿素，如下所示。14N2处理的粘液和气生根作为阴性对照。
15N自然丰度法
15N natural abundance
生物固氮(%Ndfa) 所占比例(%)由Sierra Mixe玉米(δ15Nfixing plant)和参考植物种(δ15Nref)的15N自然丰度(以delta为单位表示，‰)估算得到的。在Sierra Mixe的2011和2012年每个野外季节，我们分析了代表8-10种(视年份而定)非固氮植物地90-114个单独的玉米样本(视年份而定)和270个参考植物样本。在2010年的单时间点，我们分析了代表8种非固氮植物的12个玉米个体样本和33个参考植物样本。利用 FTA Plant Saver卡采集的DNA进行通用18S PCR分析，同时采集组织样本进行15N分析，鉴定出田间参考植物物种。使用Sigma s Extract-N-Amp Plant PCR试剂盒，根据制造商的方法进行PCR，之后用于测序和BLASTN比对。对于15N自然丰度法，在定植后2 ~ 6个月分别从田间3、4号采收Sierra Mixe玉米或对照植株的第三幼叶，并对其进行N同位素组成的分析。随着水蒸气蒸馏采用凯氏消化法测定总有机氮。根据Bremer和van Kessel的描述，对自然15N丰度进行了分析。15N的分析在 UCD Stable Isotope Facility(http://stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15n.html)进行。源于固氮的氮百分比(%Ndfa)计算如下:
“δ15N”是指稳定氮同位素，ref”是来自非固N参考植物的值，“fixing plant”是Sierra Mixe玉米，“B”是空气中的15N丰度，假设为0。
15N富集的田间实验
15N-enrichment field experiments
2016年选择了3个地点:田块3，超过十年未种庄稼的土地;田块4，种了一年玉米的土地;田块5，一直种植玉米的土地。在每个试验点建立一个完全随机区组试验设计，5个重复，4个品种。每个地块由6个matas组成，其四周由SM2的共同边界和外围的双边界包围。mata是Sierra Mixe地区传统的种植设计，类似于山上的一块地，在那里多种植物被播种在一起。每个mata种植5粒种子，对于每块地种植18株植物的则稀疏为3粒种子。Matas种植在距彼此80 × 100厘米的网格中。15N以0.36克/块的剂量以液体溶液的形式施用，每mata添加50毫升以达到所有3个区域所需的1%的富集量。
2017年，除了田块3只有H377和SM2的记录，同样的3个地点以同样的设计和记录被种植。在这三个田块中，15N以0.95克/块的剂量施用，达到所需大于1%的富集。通过使用花园喷壶，一种溶液均匀地被洒在每一块土地上，以至于整个实验区获得等量的15N富集。在施用时(V5)，用塑料袋将植物覆盖，以确保15N不直接施用于叶子上，而所有植物均可获得15N。
土壤样本取自每个地块0-60厘米的深度，混合后送到加州大学戴维斯分校土壤实验室进行分析。计算不同地点的平均值。2016年，在V9和V12，取样1个mata(3个植物)；在抽穗期，取4个样品（12种植物）。2017年，在抽穗期对6个matas（18种植物）进行了单次抽样。每次取样时，都要挖出植物以包括所有的根。由于高降雨量(2,100毫米，集中在从6月到10月得生长季节)，因此无论是参考和测试品种其根是浅的。对每个植株拍照，并记录植株数量、株高、嫩枝总鲜重、根和茎粗的数据。将整株植物切碎，磨碎，取样，在烤箱中干燥，以记录芽和根的总干重。混合良好的子样本被取走并运送到Davis处测量总氮和15N。测定各小区在各时间点的芽的总氮和Atom%15N。通过水蒸气蒸馏采用凯氏消化法测定总有机氮。15N的分析在UCD Stable Isotope Facility(http://stableisotopefacility.ucdavis.edu/
13cand15n.html)进行。
%Ndfa采用15N富集法计算，如
Atom% 过剩是用来自加州大学戴维斯分校的Stable Isotope Facility– 0.37(空气中的氮)的样品值计算出的。
氮差(%NDiff)计算方法为
以Tornado F21 and H377 的平均值为参考，计算了%Ndfa和% Ndiff。对于Ndiff的计算，根据每个时间点收获的matas调整来收获的面积。
田间数据分析
Field data analyses
使用R lme4软件包进行数据分析。检查数据的异常值，并使用最小显着差异法（p = 0.05）对每个地点的数据进行ANOVA和均值比较。只有当ANOVA F-tests在p = 0.05显著时才计算LSDs。对于%Ndfa和%Ndiff，计算单自由度对比，以比较试验品种与参考品种的平均值 (P > 0.05)。计算%Ndfa与%Ndiff之间的Pearson相关系数。
编译：马腾飞 南京农业大学
责编：刘永鑫 中科院遗传发育所
Reference
Van Deynze A, Zamora P, Delaux P-M, Heitmann C, Jayaraman D, Rajasekar S, et al. (2018) Nitrogen fixation in a landrace of maize is supported by a mucilage-associated diazotrophic microbiota. PLoS Biol 16(8): e2006352.doi:10.1371/journal.pbio.2006352
PLOS Biology: 发现一种固氮玉米
https://mp.weixin.qq.com/s/hLFHUryPyHiO1JaOuHf0hA
中国科学：玉米可利用气生根进行高效生物固氮
https://mp.weixin.qq.com/s/iIRn2bthKAgZ-HOXqsE8hQ
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学习16S扩增子、宏基因组科研思路和分析实战，关注“宏基因组”
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