Nature | 张祯威等解析人类17S U2 snRNP三维结构

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剪接体是负责移除pre-mRNA 中内含子并连接外显子的高度复杂的巨大核糖核蛋白（RNP）复合体。剪接体由5个核内小分子核糖核蛋白（snRNP）:U1 snRNP, U2 snRNP, U4/U6.U5 tri-snRNP和其他非snRNP蛋白质组成。近5年，冷冻电镜（cryo-EM）技术为pre-mRNA剪接领域带来革命性的进展。完整组装的剪接体各个主要状态，以及组成剪接体的亚基U1 snRNP以及U4/U6.U5 tri-snRNP的高分辨率已经被解析【1-3】。这些结构为了解剪接体如何形成催化中心，其催化的化学机制，以及晚期结构变化打下了重要基础。

U2 snRNP包含一个U2 snRNA，它是选择分支位点腺苷（Branch site adenosine, BS-A），即剪接反应中第一步转脂反应的亲核试剂的关键【4】。U2 snRNP通过其U2 snRNA的分支位点识别序列与内含子上保守的分支位点（Branch site, BS）序列碱基配对，形成U2-BS RNA双螺旋，使BS-A从双螺旋中突出并被选择。U2-BS RNA双螺旋的形成以及BS-A的选择是A complex形成的必要条件（图1）。然而，由于早期不完全组装剪接体的高度不稳定性，目前对于早期剪接体结构的研究还有许多空白，特别是人源的E complex，A complex，以及他们的重要组成部分 17S U2 snRNP的结构仍然未知。因此解析17S U2snRNP的三维结构将为理解剪接体起始机制起到极大的推动。

 图1：剪接体组装示意图

2020年6月3日，德国马克思普朗克生物物理化学研究所（MPIbpc）的Holger Stark组, Reinhard Lührmann组（张祯威、Cindy Will为共同一作）在Nature合作发表题为 Molecular architecture of the human 17S U2 snRNP的研究文章，首次解析了17S U2 snRNP的三维冷冻电镜结构。17S U2 snRNP主要由两大部分组成：5’端区域和3’端区域（图2）。由于17S U2 snRNP的高度不稳定性，作者获得了5’端区域4.2 Å 分辨率的结构，并构建了模型。而3’端区域以及周边连接区域仅有10-30 Å 分辨率。在蛋白质交联质谱数据的指引下，作者同样为低分辨率区域构建了模型，并获得了完整的17S U2 snRNP分子模型。

 图2：17S U2 snRNP电镜密度图及分子模型

此前发表的人源剪接体结构中，U2 snRNP的SF3B1蛋白通过闭合构象紧紧包裹BS-U2 双螺旋，并形成一个蛋白质口袋稳定突出的BS-A【5,6】。然而在17S U2snRNP中，作者发现SF3B1蛋白处于开放的构象。因此可以推断，在U2 snRNP稳定整合到A complex过程中（即E complex到A complex的转化过程中），SF3B1需要进行从开放到闭合的构象转变。

此前Manuel Ares组【7】通过遗传学手段，在酵母中发现U2 snRNA与BS碱基配对的分支位点识别序列被包裹在一个RNA发卡环结构中，并命名为branchpoint-interacting stem loop，BSL（图3-a）。因此U2 snRNA与BS碱基配对之前，需要BSL解旋。然而在人类细胞中，从未发现BSL存在的证据，因此学界仍然沿用Manuel Ares在1990年提出的模型【8】，并默认这段U2 snRNA序列为单链RNA （图3-b）。令人惊讶的是，作者在人类17S U2 snRNP中观察到了U2snRNA同样形成BSL的结构。这个发现不仅证实了Ares组的BSL模型，且首次给出了BSL在人类中存在的直接证据（图3）。这将完全改变学界对于人类U2 snRNA结构的认识。

图3：U2 snRNA在17S U2 snRNP中形成BSL

PRP5和TAT-SF1是17S U2 snRNP的组成部分[9]，然而TAT-SF1的功能此前并不明确。作者发现17S U2 snRNP中，BSL被PRP5 RecA，TAT-SF1，以及SF3B1蛋白包裹并隔离。此外，PRP5的N端区域以及TAT-SF1通过与SF3B1结合，从而稳定着SF3B1的开放状态（图4）。也就是说PRP5以及TAT-SF1通过包裹BSL，并与SF3B1结合，从而抑制BSL过早的解旋以及SF3B1过早的闭合。这也与先前生化研究发现PRP5可能在A complex形成过程中参与校对作用的结论不谋而合【9】。因此，在E complex 到A complex转化的过程中，U2-BS双螺旋的形成以及SF3B1的闭合都需要PRP5以及TAT-SF1被移除。

 图4：PRP5 和TAT-SF1包裹BSL并维持SF3B1的开放状态

结合先前20多年积累的各组对U2 snRNP研究的生化数据，作者提出了从E complex到A complex转变中，U2 snRNP选择BS并发生构造变的模型（图5）：在E complex中，PRP5消耗ATP并移除TAT-SF1和PRP5 RecA，从而释放BSL，并允许BSL的顶端与内含子BS保守序列进行碱基配对（图5-b）。作者认为，此时PRP5的N端区域仍然与SF3B1结合，并稳定SF3B1的开放构型。BSL随后完全解旋并与BS配对，形成U2-BS双螺旋。U2-BS双螺旋将BS-A置放于SF3B1的蛋白质口袋中（图5-d）。BS-A的插入将促使SF3B1进行构象转变并闭合，并促使PRP5与SF3B1分离，最终形成A complex（图5-e）。作者认为只有正确形成的U2-BS双螺旋才能将BS-A稳定地置于SF3B1的蛋白质口袋中，并促使PRP5的离去。通过这样的机制，PRP5可以起到校对U2-BS双螺旋的作用，确保正确BS-A的选择。这也是首次对PRP5如何起到校对作用的分子机制提出可能的解释。

 图5：U2 snRNP在A complex形成过程中的构造变化模型

值得一提的是，SF3B1蛋白上有许多和癌症相关的突变位点【10】。然而这些突变如何导致癌症发生的分子机制并不明确。作者结合17S U2 snRNP的结构以及蛋白质交联质谱结果，发现PRP5的N段区域保守的DPLD序列正好位于SF3B1突变高发区域附近。结合PRP5校对U2-BS双螺旋的机制，以及先前在酵母中研究发现SF3B1突变抑制PRP5结合的结论【11】，作者推测SF3B1的突变破坏了其与DPLD序列的结合作用，导致PRP5与SF3B1的结合受到影响，从而破坏PRP5的校对作用并导致错误剪接，最终引发癌症。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2344-3

1. Plaschka C, Newman AJ, Nagai K. Structural Basis of Nuclear pre-mRNA Splicing: Lessons from Yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2019;11(5):a032391. Published 2019 May 1. doi:10.1101/cshperspect.a032391

2. Yan C, Wan R, Shi Y. Molecular Mechanisms of pre-mRNA Splicing through Structural Biology of the Spliceosome. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2019;11(1):a032409. Published 2019 Jan 2. doi:10.1101/cshperspect.a032409

3. Kastner B, Will CL, Stark H, Lührmann R. Structural Insights into Nuclear pre-mRNA Splicing in Higher Eukaryotes. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2019;11(11):a032417. Published 2019 Nov 1. doi:10.1101/cshperspect.a032417

4. Black DL, Chabot B, Steitz JA. U2 as well as U1 small nuclear ribonucleoproteins are involved in premessenger RNA splicing. Cell. 1985;42(3):737‐750. doi:10.1016/0092-8674(85)90270-3

5. Haselbach D, Komarov I, Agafonov DE, et al. Structure and Conformational Dynamics of the Human Spliceosomal Bact Complex. Cell. 2018;172(3):454‐464.e11. doi:10.1016/j.cell.2018.01.010

6. Zhang X, Yan C, Zhan X, Li L, Lei J, Shi Y. Structure of the human activated spliceosome in three conformational states. Cell Res. 2018;28(3):307‐322. doi:10.1038/cr.2018.14

7. Perriman R, Ares M Jr. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Mol Cell. 2010;38(3):416‐427. doi:10.1016/j.molcel.2010.02.036

8. Ares M Jr, Igel AH. Lethal and temperature-sensitive mutations and their suppressors identify an essential structural element in U2 small nuclear RNA. Genes Dev. 1990;4(12A):2132‐2145. doi:10.1101/gad.4.12a.2132

9. Agafonov DE, Deckert J, Wolf E, et al. Semiquantitative proteomic analysis of the human spliceosome via a novel two-dimensional gel electrophoresis method. Mol Cell Biol. 2011;31(13):2667‐2682. doi:10.1128/MCB.05266-11

10. Liang WW, Cheng SC. A novel mechanism for Prp5 function in prespliceosome formation and proofreading the branch site sequence. Genes Dev. 2015;29(1):81‐93. doi:10.1101/gad.253708.114

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12. Tang Q, Rodriguez-Santiago S, Wang J, et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes Dev. 2016;30(24):2710‐2723. doi:10.1101/gad.291872.116