NBT：设计稳定无毒的抗菌肽杀灭耐药菌
设计稳定无毒并在小鼠中杀死抗生素抗性细菌的广谱抗菌肽
Design of stapled antimicrobial peptides that are stable, nontoxic and kill antibiotic-resistant bacteria in mice
Nature Biotechnology [IF:31.864]
2019-08-19 Articles
DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-019-0222-z
第一作者：Rida Mourtada1,2,3
通讯作者：Loren D. Walensky1,2*
其它作者：Henry D. Herce, Daniel J. Yin, Jamie A. Moroco, Thomas E. Wales, John R. Engen
主要单位：
1 美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所儿童肿瘤科(1Department of Pediatric Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA)
2 美国马萨诸塞州波士顿Dana-Farber癌症研究所癌症化学生物学林德项目(Linde Program in Cancer Chemical Biology, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA)
热心肠日报
http://www.mr-gut.cn/papers/read/1033641332
Nature子刊：设计稳定无毒的广泛抗菌肽杀灭耐药菌
创作：刘永鑫 审核：刘永鑫
原标题：设计稳定无毒并在小鼠中杀死抗生素抗性细菌的广谱抗菌肽
阳离子α-螺旋抗菌肽(AMP)存在结构不稳定性、蛋白水解降解和非特异性膜裂解毒性等问题；
本文提出了基于magainin II的58个stapled AMP(StAMPs)成员并应用结构-功能-毒性测量方法，设计稳定、抗蛋白酶、有效和无毒的StAMP算法；
该方法设计的一种铅双重StAMP可以杀死多种耐药的革兰氏阴性病原体，并在小鼠毒性研究中没有观察到溶血或肾损伤；
仅输入氨基酸序列产生了一系列膜选择性的StAMPs，展现了设计平台的通用性。
主编评语：抗生素耐药问题是当今微生物组研究最热点的问题之一，本文提出人工设计抗菌肽角度攻克耐药菌，在小鼠实验中取得较好成功，较抗生素相比更不容易产生耐药抗性，是开发新型抗生素、噬菌体疗法等方法外的有效补充，是人类对抗耐药菌又一有利武器。
摘要
阳离子α-螺旋抗菌肽（AMP）的临床转化受到结构不稳定性，蛋白水解降解和非特异性膜裂解导致体内毒性等诸多问题的阻碍。虽然疏水性含量和电荷分布的分析得知，设计合成的AMP具有增加的效力和减少的体外溶血，但体内非特异性膜毒性继续阻碍AMP药物开发。
在这里，我们分析了基于magainin II的58个stapled AMP成员（StAMPs），并应用了结构 - 功能 - 毒性测量的方法，设计了一种稳定、抗蛋白酶、有效和无毒的StAMP原型设计算法。我们表明，一种名为Mag（i + 4）1,15（A9K，B21A，N22K，S23K）的铅双重StAMP可以杀死多药耐药的革兰氏阴性病原体，如小鼠腹膜炎中的粘菌素抗性鲍曼不动杆菌 - 脓毒症模型，在小鼠毒性研究中没有观察到溶血或肾损伤。单独输入氨基酸序列，我们进一步产生了膜杀菌素、CAP18和esculentin的膜选择性StAMPs，突出了我们设计平台的普遍性。
The clinical translation of cationic α-helical antimicrobial peptides (AMPs) has been hindered by structural instability, proteolytic degradation and in vivo toxicity from nonspecific membrane lysis. Although analyses of hydrophobic content and charge distribution have informed the design of synthetic AMPs with increased potency and reduced in vitro hemolysis, nonspecific membrane toxicity in vivo continues to impede AMP drug development. Here, we analyzed a 58-member library of stapled AMPs (StAMPs) based on magainin II and applied the insights from structure–function–toxicity measurements to devise an algorithm for the design of stable, protease-resistant, potent and nontoxic StAMP prototypes. We show that a lead double-stapled StAMP named Mag(i+4)1,15(A9K,B21A,N22K,S23K) can kill multidrug-resistant Gram-negative pathogens, such as colistin-resistant Acinetobacter baumannii in a mouse peritonitis–sepsis model, without observed hemolysis or renal injury in murine toxicity studies. Inputting the amino acid sequences alone, we further generated membrane-selective StAMPs of pleurocidin, CAP18 and esculentin, highlighting the generalizability of our design platform.
主要结果
图1. 文库的抗微生物和溶血活性
Fig. 1: Antimicrobial and hemolytic activities of an i, i+4-stapled Mag2 library.
a，基于Mag2序列测定肽文库的抗微生物活性（MIC，μgml-1）和25μgml-1的RBC溶血百分比。
b，两亲性Mag2 α-螺旋（蛋白质数据库ID：2MAG）的疏水（左）和亲水（右）面的表面和带状视图。
c，当烃类短纤维（由黑色椭圆形表示）位于高疏水性的贴片内时，例如在Mag（i + 4）1和Mag（i + 4）16中，或在α-的亲水面上螺旋
图2. 疏水网络映射预测哺乳动物细胞裂解
Fig. 2: Hydrophobic network mapping predicts mammalian cell lysis.
a，Mag2的HNM描绘了沿α-螺旋z轴的疏水残基的i + 3和i + 4关系。每个连接的厚度反映了连接的氨基酸的组合疏水性。
b，Mag（i + 4）15的HNM显示，当钉在高疏水性的既定补片内时，疏水相互作用的数量保持不变，相互作用的强度可以增加（例如，X16-X20） ，X20-V17）。
c，当钉在疏水贴片外部时，如在Mag（i + 4）18中，HNM证明疏水连接的数量和这些相互作用的强度增加。
d，Mag（i + 4）15赖氨酸扫描文库的比较抗微生物和溶血活性表明，位点特异性赖氨酸取代可以减弱溶血活性，同时保持对革兰氏阴性病原体的抗微生物效力。MIC是三次独立实验的几何平均值。
e，Mag（i + 4）15（A9K）的HNM显示A9K诱变切断连续疏水网络，从而减少高度疏水连接的数量。
f，计算的LI与RBC溶血百分比的关系曲线分布来自Mag（i + 4）主食扫描和Mag（i + 4）15赖氨酸扫描文库（n = 36种不同的StAMPs）的StAMPs沿对数选择性连续体，由Pearson相关性计算的R2值为0.995。
图3. 细菌选择性StAMP的跨膜插入机制。
Fig. 3: Transmembrane insertion mechanism of bacterial-selective StAMPs.
a，b，与水性对照条件相比氘交换减少所反映的StAMP-膜相互作用是阴离子脂质体（POPC：POPG） - 对于Mag（i + 4）16（a）的选择性，但对Mag来说是混杂的（i + 4）18（b），其至少部分受阴离子和两性离子（POPC：胆固醇）脂质体的保护。HX-MS实验独立进行三次，结果相似。
c-f，QCM传感图显示在暴露于6μg ml-1（c）和24μg ml-1（d）的Mag（i + 4）16时，模拟细菌膜（POPC：POPG）的SLB共振频率的变化（蓝色）和Mag（i + 4）18（红色）肽和哺乳动物膜（POPC）暴露于6μg ml-1（e）和24μg ml-1（f）的Mag（i + 4）16和Mag（i + 4）18肽，穿过第三，第七和第十三次谐波，分别探测外部小叶脂质头部 - 水界面（实线），双层中间（虚线）和内部小叶头组（点缀线）。对于每种条件，示出了示例性传感图，用于以相似结果独立执行两次的实验。
g-j，POPC（g）组成的SLB指示的StAMP处理（8μgml-1），在第三（蓝色），第七（红色）和第十一（黑色）谐波上的共振频率的测量变化增加胆固醇浓度（h-j）。显示的数据是两次独立实验的平均值（显示为点）。
图4. 双钉StAMP的生物物理，生物和安全性概况
Fig. 4: Biophysical, biological and safety profile of a double-stapled StAMP.
a，Mag（i + 4）15（A9K）的第二个主要扫描文库的HNM分析揭示了双钉Mag（i + 4）1,15（A9K）构建体的溶解度谱和预测的最佳性质谱。然后合成并在一系列生物物理和生物分析中进行表征。
b，与Mag（i + 4）15（A9K）相比，Mag（i + 4）1,15（A9K）的HNM在已建立的N-末端疏水补片内表现出更强的疏水相互作用，但保留了密钥之间的关键断开。N-和C-末端高度疏水的表面。
c，Mag（i + 4）1,15（A9K）（绿色）在溶液中显示稳定的α-螺旋结构，而Mag2（黑色）是无规卷曲，如通过圆二色光谱法独立地进行两次评估，具有相似的结果。
d，显示Mag2（黑色）的蛋白水解降解与暴露于蛋白酶K时Mag（i + 4）1,15（A9K）（绿色）的蛋白水解抗性的数据。显示的数据是平均值±s.d.三个独立实验（显示为点）。
e，Mag（i + 4）1,15（A9K）显示出针对革兰氏阴性病原体（例如大肠杆菌和铜绿假单胞菌）的有效抗微生物活性，MIC值<5μgml-1。MIC是四次独立实验的几何平均值。
f，Mag（i + 4）1,15（A9K）在广泛的剂量有效范围内没有显示出RBC溶血活性，并且即使当给药高达400μg/ ml时，它也表现出<20％的溶血。RBC溶血测试独立进行两次，结果相似。革兰氏阴性杀菌剂量范围以黄色突出显示。
g，数据显示Mag（i + 4）1,15（A9K）对来自美国疾病控制和预防中心的多重耐药革兰氏阴性临床分离株的抗菌效力，包括粘菌素抗性鲍氏不动杆菌和MCR-1质粒阳性大肠杆菌。S，易感;我，中间; R，耐; Amp，氨苄青霉素;头孢他啶，头孢他啶; CTX，头孢曲松; Cipro，环丙沙星; Cst，粘菌素;根特，庆大霉素; Mero，meropenem; Tob，妥布霉素。†MCR-1质粒载体。
h，鲍曼不动杆菌的粘菌素和Mag（i + 4）15（A9K）敏感菌株暴露于相应抗生素的亚MIC下30天，在暴露7天内导致大肠杆菌抗性，但持续易感性MAG（1 + 4）15（A9K）。实验独立进行两次，结果相似。
i，数据显示用Mag（i + 4）15（A9K）处理的小鼠的RBC参数和肝和肾功能测试的结果，静脉内剂量为5mg / kg，每天两次，持续8天。显示的数据是平均值±s.d.用于在n = 8只小鼠（4只雄性和4只雌性）上进行的试验。
图5. 用于临床前开发的铅StAMP的优化特性。
Fig. 5: Optimized properties of a lead StAMP for preclinical development.
a，对于基于Mag（i + 4）15（A9K）的StAMPs的突变组，测定抗菌活性（MIC，以μgml-1为单位）和HRPTECs在100μ gml-1下的LDH释放百分比。MIC是两次独立实验的几何平均值。LDH释放百分比（裂解）数据是两次独立实验的平均值。
b，比较LDH释放测定，证明在Mag（i + 4）15（A9K）的B21A / N22K / S23K诱变后消除HRPTEC裂解。数据是两次独立实验的平均值（显示为点）。
c，等离子体稳定性测试显示，对于Mag（i + 4）15（A9K）和Mag（i），双钉将未浸泡模板肽Mag2的血浆半衰期从2小时增加到大于6小时和8小时。+ 4）15（A9K，B21A，N22K，S23K）。显示的数据是平均值±s.d.三个独立实验（显示为点）。
d，用Mag（i + 4）15（A9K，B21A，N22K，S23K）处理的CD-1小鼠的RBC参数和血清肌酸酐水平，静脉内剂量为 5 mg / kg，每天给药两次，持续5天。显示的数据是平均值±s.d.用于在n = 8只雌性小鼠上进行的测试。
e，来自用Mag（i + 4）15（A9K，B21A，N22K，S23K）处理的n = 8的代表性小鼠的H＆E染色的肾切片，静脉内剂量为5mg / kg，每天施用两次，持续5天。正常组织和细胞结构。由虚线方框划分的组织区域在面板中向右连续扩大。
图6. 各种膜选择性StAMP的计算设计
Fig. 6: Computational design of diverse membrane-selective StAMPs.
a，测定一系列胸膜张素（pleu），CAP18（CAP）和基于esculentin（Esc）的双钉StAMPs的抗菌活性（MIC，单位为μg ml-1）和25μg ml-1的RBC溶血百分比。基于计算设计算法预测具有低哺乳动物膜裂解性。MIC是两次独立实验的几何平均值。溶血百分比的数据是三次独立实验的平均值。
b，基于单钉和双钉的胸膜刺激素StAMP的序列组成和LI。
c，pleurocidin StAMPs的比较剂量反应性溶血，突出显示组合物之间的显着差异，如b中相应的LI所预测的。数据是两次独立实验的平均值（显示为点）。
d-f，pleurocidin StAMPs和相应的HNMs的不同疏水面的表面视图。每个StAMP的装订位置用黑色椭圆表示。
g，用于临床前测试和临床翻译的铅StAMP计算设计的工作流程。
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