追踪带毒三文鱼，Science 给出这种解决方法，「夏洛克」再显神威！
以下文章来源于丁香学术 ，作者我演戈多
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近日，北京新发地市场的新冠疫情引发了全国人民的关注。几天内，已经连续 2 个月没有出现社区病例的北京市先后检测出数十例新冠肺炎确诊病例以及多名咽拭子阳性患者，所有的病例都与新发地市场有关。
随后的环境样本检测中，检测人员在新发地市场的三文鱼案板中检测出新冠病毒。由于新冠病毒感染进口三文鱼的可能性极低，业内人士认为很有可能是因为三文鱼在冷链运输之前被污染，随后北京禁止了一切生鲜产品的进口，多家超市也紧急下架了所有三文鱼。
由于跨国运输供应链的复杂，追踪这些三文鱼的来源变得非常困难。如何有效跟踪全球化趋势下的物流递送系统，知道某个特定物品还何时出现过在何地，对现阶段的疫情防控至关重要。
图片来源：Science
无巧不成书，就在北京疫情爆发之前的 6 月 5 号，来自哈佛医学院的 Michael Springer 所带领的团队就在当期 Science 上发表了题为《Barcoded microbial system for high-resolution object provenance》的短文 [1]。讨论了使用合成生物学手段制造微生物条形码来追踪物流系统的可能。
研究内容
图片来源：Science
为了设计基于微生物的条形码体系，研究团队提出了四个基本原则。
1）所选用微生物必须适合工业级别的大规模生产；
2）合成的孢子必须在野生环境下无法存活以避免潜在的生态影响；
3）合成的孢子必须能够在环境中稳定存在以标记物品
4）编码以及解码过程的速度、敏感度以及特异性应该足够高
基于这四个原则，研究人员合成设计了微生物孢子系统条形码（Barcoded Microbial Spores ，BMS)。BMS 初代系统利用了自然界中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）孢子能够长时间在环境中留存且停止生长的能力。通过往它们基因组中引入特定的非冗余 DNA 条形码，赋予了这些这些微生物近乎无限的识别码序列。
通过工业级的生产后，将携带条形码喷洒在物品或者物品的包装之上，就能在追踪物品的去向，甚至物品在运输过程中接触的人和其他物品。如果需要识别物品，可以用张锋团队所研发的「夏洛克」系统、qPCR 和测序进行识别。在使用「夏洛克」的验证实验中，研究人员证明 BMS 系统能够被「夏洛克」精准的识别。在采用作者优化过的特殊孢子裂解方法后，使用「夏洛克」的检测分辨率能达到单孢子级别。
BMS 在各种环境中保持稳定
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在确定识别方法的准确性后，研究人员着手解决了 BMS 在物品运输过程中的稳定性。结果显示，BMS 系统能在沙子、土壤、地毯和木质材料的表面稳定存在。模拟的各种干扰，包括风吹雨淋与清理打扫都不会影响 BMS 被检测出的能力。
在构建的 100 平米的室内沙坑模拟中，喷洒过 BMS 的区域在 3 个月后还能使用「夏洛克」轻易检测到 BMS 。而且干扰并不会使 BMS 污染到之前未被喷洒过的区域。非常剧烈的干扰以及室外环境的影响都不会对检测范围和时限造成过大的干扰。在室外环境下，BMS 在 5 个月后依旧能被检测出。
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在实验室条件中确定了 BMS 的准确性和稳定性后，能否在日常生活中实际应用 BMS 就成为下一个需要解决的问题。BMS 可以用来标记物品是否在一个地方通过或者停留。所以研究人员模拟了人员通过被 BMS 标记过的地板的情景，并通过简易的手机、可移动光源和滤镜来收集「夏洛克」结果模拟了日常生活中的使用。并成功确定了鞋子的运动轨迹。定量分析发现，对物品发源地检测的假阳性率为 0.6%，假阴性率为 0%，意味着 BMS 有在日常生活中使用的可行性。
BMS 能够标记农作物
图片来源：Science
最后，研究人员还构建出了另一种独特的应用场景，也适用于本次三文鱼相关疫情的溯源工作。食物中毒是很常见的一种疾病，但食品来源的鉴别往往非常困难，所以研究人员尝试将 BMS 应用于食物来源的识别中。多种微生物本身就是 FDA 批准过杀虫剂，所以在这些微生物杀虫剂中引入 BMS 系统能实现杀虫和标记的双重功效。在模拟正常杀虫剂的喷洒过程后，研究人员成功在农作物的叶片和土壤中检测出了 BMS。
由于日常生活中农作物在加工过程会参杂在一起，研究人员还研究了参杂过程会不会影响 BMS 溯源的稳定性。结果显示，BMS 在不同植物叶片之间的交叉传播远低于此前研究的其他物品。在参杂后，研究人员还能通过「夏洛克」和测序识别去该植物的来源。清洗和烹煮食物过后，研究人员依旧能在食品中检测出微生物的 DNA。这些数据证明了 BMS 能够运用到食品的溯源工作中来。
研究意义
这篇应用型短文证明了利用能够大规模生产的工程菌孢子来溯源的可能性。这种能在不同条件下稳定存在的 BMS 系统在识别中的准确性极高，且可以从多种材质表面转移到通过的物体之上；同时，能够标记沙子，木头，地毯和土壤等多种难以标记的材质也是其他系统不具备的优势之一；另一方面，利用实验室设备和便携式设备都能准确、快速的识别物品的来源地。这些特性给予了 BMS 在现实世界农业、商业以及刑侦中广泛运用的潜能。
与此同时，作者为了不影响生态，特意选用了没有生长能力的孢子，采用的菌株也是食物中常见的菌株，这为 BMS 的安全性也提供的保障。但目前为止，这项研究的所有工作是在实验室中完成。尽管作者极力模拟了真实世界中的应用情景，但真实世界中的应用远比研究中的情境复杂，BMS 在实战表现如何还需要更多检验才能得知。
延伸阅读
作者利用微生物对物品进行追踪的想法虽然惊艳，但也是从前人的研究中获得了灵感。
图片来源：Science
2014 年，来自美国芝加哥大学的 Jack A. Gilbert 团队就在 Science 上报道了人体微生物对人类所生活的室内环境的影响，这篇以《Longitudinal analysis of microbial interaction between humans and the indoor environment》为题的论文揭示了物体表明会沾染因人而异的微生物标记 [2]。
图片来源：Microbiome
这项研究的结果也让通讯作者在后续的一篇发表在 Microbiome 上题为《Forensic Analysis of the Microbiome of Phones and Shoes》的论文 [3] 中首次提出了利用微生物对物品进行溯源的可能。
图片来源：Cell
2018 年，来自斯坦福大学的 Michael Snyder 团队在 Cell 上发表了题为《Dynamic Human Environmental Exposome Revealed by Longitudinal Personal Monitoring》的论文也证明物体能够从环境中慢慢获得独有的微生物标记 [4]。
正是这些研究的出现，促成了 BMS 的诞生。由于正常的农产品本身就携带大量与其共生的微生物，所以 BMS 在农产品物流的溯源过程中有着得天独厚的优势。相信这项技术的应用能够完全改变食物溯源的现状，帮助我们快速找到问题食品的来源。
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参考文献：