Cell丨 “外星人”入侵，病毒感染产生人——病毒嵌合蛋白
撰文 | 咸姐
责编 | 兮
在真核mRNA的5’-末端的帽子结构包含一个7-甲基尿苷（m7G），该部分通过5’-5’三磷酸桥连接到转录本的第一个核苷酸上。该帽子结构具有许多重要的生物学作用，如保护mRNA不被降解、指导mRNA前体的剪接以及mRNA从细胞核的输出。此外，帽子结构可以稳定mRNA，保证其被真核生物翻译起始因子4E（eIF4E）有效识别并翻译。而5’端未被帽子结构保护的RNA，如某些新生成的病毒RNA，则会被细胞当作“异己”被排除，但是，一些病毒可以通过机智的与宿主的协同进化的方式来保存自己，比如某些RNA病毒【1】。
RNA病毒（包括最近流行的新冠病毒）一直以来都是人类健康的一大威胁，而RNA病毒感染后的生存和增殖将依赖于宿主细胞的许多过程，其中就包括细胞转录机制。最典型的例子就是RNA病毒的一大亚门——分段负链RNA病毒（sNSV），包括高传染性的甲型流感病毒（IAV）和拉沙病毒（LASV）。sNSV不能自主合成其mRNA的5’-帽子结构，但是其病毒聚合酶可以切割宿主细胞内的mRNA的5’-帽子结构，并利用由此产生的寡核苷酸作为其转录的启动，这一“抢帽”（cap-snatching）机制（图1）涉及病毒的帽结合位点和RNA内切酶，具有病毒特异性，且对病毒的增殖至关重要。由此产生的病毒转录本是宿主和病毒序列的遗传杂交，同时由宿主衍生的5’-端序列具有高度多样性，一旦形成，病毒mRNA就能被宿主机制翻译成蛋白【2,3】。
图1 sNSV转录期间的“抢帽”机制
在真核生物中，核糖体翻译通常先识别具有5’-端帽子结构的mRNA，而其后一般跟着长度为几十到几百核苷酸的非翻译区（UTR），然而，越来越多的研究表明，翻译可以在很大一部分真核mRNA的5’-UTR中启动，有时非常接近5’-帽子结构，从而产生上游开放阅读框（uORF）【4】。那么sNSV通过宿主获取的5’-端RNA序列是否可以使其获得具有功能的上游启动密码子（uAUG）呢？这样的杂交基因对于病毒的感染又有什么特别的作用呢？
近日，来自美国西奈山伊坎医学院的Ivan Marazzi研究团队在Cell上在线发表题为Hybrid Gene Origination Creates Human-Virus Chimeric Proteins during Infection 的文章，发现RNA病毒如流感病毒感染过程中，被“抢帽”的宿主转录本中的起始密码子可以产生具有编码潜能的嵌合人-病毒mRNA，这种被称为“起始抢夺”的机制使得宿主和病毒的UTR得以翻译，通过基因叠加产生N-末端延伸的病毒蛋白或者全新的多肽，从而引起T细胞反应，促进毒性。以此提出了病毒感染期间一种新的宿主依赖性的允许杂交基因产生的机制。
除了传统的“抢帽”机制来表达编码典型病毒蛋白的病毒基因（图2，OUTCOME1），倘若宿主序列内的AUG可以产生具有编码潜力的上游宿主-病毒嵌合ORF（即“起始抢夺”机制）的话，根据阅读框的不同，宿主来源的上游起始密码子（uAUG）可能启动两个新的编码N末端延伸的病毒蛋白的嵌合基因的合成，或者产生一个叠加在典型的病毒ORF上的完全新的蛋白质（图2，OUTCOME2）。而这两个结果将依赖于两个假设：1）uAUG存在于被抢帽的宿主序列中，并且能够启动翻译；2）从病毒UTR转录的5’mRNA应该缺少终止密码子。
为了证明第一个假设，本文的研究人员测定了感染IAV的A549细胞产生的去帽和5’末端测序（DEFEND-seq）数据库中的被抢帽的宿主序列中的uAUG丰度，结果证明IAV抢帽序列中包含uAUG，同时表明在感染时，病毒和宿主细胞似乎都不能阻止具有杂交编码潜力的嵌合RNA的形成。对于第二个假设，生物信息学分析发现IAV的8个基因组片段中有5个（PB2、HA、NP、NA和NS）的5’-UTR缺少与主要ORF同框的上游终止密码子，而上游病毒ORF（uvORF）存在于所有8个基因组片段中，因此，若获得含有uAUG的宿主来源的RNA，则可以产生不同长度的多肽。
如果被抢帽的宿主uAUG确实能够启动病毒5’-UTR的翻译，那么病毒mRNA的5’-末端应该被起始核糖体所结合。基于此，本文研究人员随后在三尖杉酯碱（其可以阻止80S起始复合物从头合成的延伸，但不会阻止已经参与延伸的复合物）的存在下，对感染的细胞进行核糖体谱分析。结果显示，尽管启动频率低于经典的起始密码子，但是在病毒mRNA嵌合体中，翻译可以由被抢帽的宿主来源的uAUG所启动。进一步地，为了证明这类人-病毒嵌合蛋白在感染过程中的表达，研究人员对来自感染细胞的细胞裂解物进行了质谱分析，鉴定出了IVA感染细胞中两种不同的多肽，分别来自于IAV的PB1和PB2片段中的长的重叠的uvORF，称为PB1-UFO和PB2-UFO（UFO：Upstream Frankenstein ORF，上游奇特ORF），以及一个由NP片段中UTR编码的N末端延伸蛋白（NP-ext）。通过对三个蛋白的定量分析表明，尽管它们的含量不如典型的病毒蛋白丰富，但是它们在感染细胞内的表达水平都是可以检测到的，由此证实，在IAV感染期间，N端延伸和重叠的uvORF被合成，并在感染细胞中以适当的丰度表达，而且深入实验表明其可被T细胞识别，被适应性免疫系统检测到。与此同时，研究人员还发现uvORF的敲除虽然不会影响病毒的复制，但是uvORF可以调节病毒在体内感染的严重程度。
此外，研究人员证实，NP-ext和PB1-UFO在IAV的多个病毒株中高度保守。进一步的分析表明，PB1-UFO的保守性在很大程度上取决于保持PB1-ORF的病毒UTR核苷酸序列和氨基酸序列的需要，也表明PB1-UFO ORF的进化在很大程度上受到趋同选择压力的限制。值得注意的是，高亲和力的HLA表位对主要集中在保守性低的PB1-UFO区域，提示PB1-UFO的免疫相关压力可能导致蛋白质的一些多样性选择。
那么，在IAV中发现的这种“起始抢夺”机制是否也适用于其他类型的sNSV呢？答案是肯定。这种嵌合病毒-宿主ORF的产生是sNSV的共同特征。而考虑到病毒mRNA和蛋白质是感染细胞中表达最丰富的生物类型之一，研究人员认为所有具有“抢帽”机制的病毒都可以通过从宿主细胞抢走起始uAUG来扩展其蛋白质组。
综上所述，本研究揭示了病毒-宿主之间的一种新关系，描述了一种由sNSV产生的嵌合型宿主-病毒基因的机制，即“起始抢夺”，其几乎适用于所有类型的sNSV，包括主要的人类病原体IAV和LASV，并且该机制可以启动病毒mRNA中宿主来源序列中的uAUG，从隐藏的uvORF起始翻译蛋白质，从而可以在感染的细胞中检测到嵌合型宿主-病毒蛋白的表达，这些蛋白或是具有N末端延伸的典型病毒蛋白，或是叠加在典型病毒ORF上的新产生的UFO蛋白，以此从宿主mRNA序列中选择起始密码子来扩展病毒自身的蛋白质组，从而调节病毒的感染能力。
制版人：十一
参考文献
2. Plotch, S.J., Bouloy, M., Ulmanen, I., and Krug, R.M. (1981). A unique cap (m7GpppXm)-dependent influenza virion endonuclease cleaves capped RNAs to generate the primers that initiate viral RNA transcription. Cell 23, 847–858.
3. Tobias Holm, Janine-Denise Kopicki, Carola Busch etal. (2018). Biochemical and Structural Studies Reveal Differences and Commonalities Among Cap-Snatching Endonucleases From Segmented Negative-Strand RNA Viruses. J Biol Chem 21;293(51):19686-19698.
4. Calvo, S.E., Pagliarini, D.J., and Mootha, V.K. (2009). Upstream open reading frames cause widespread reduction of protein expression and are polymorphic among humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 7507–7512.