索氏梭菌毒素TcsL的宿主细胞受体以及结合受体特异性的机制

来源：BioArt

索氏梭菌（Paeniclostridium sordellii或Clostridium sordellii）是一种厌氧革兰氏阳性细菌，存在于土壤以及动物和人的胃肠道和阴道中。尽管大多数携带者无症状，但致病性P. sordellii感染迅速并且具有很高的致死性。致病性P. sordellii菌株的起源尚不清楚，但大多数感染发生在分娩或流产后的妇女中。高死亡率的主要原因是致命毒素TcsL，它属于大型梭菌毒素（large clostridial toxin  LCT）家族。LCT通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞，进行自我加工后，释放细胞毒性。

大部分的LCT序列非常相似，但是它们作用的组织特异性以及对宿主细胞的影响不同。 TcsL与艰难梭菌细胞毒素TcdB最紧密相关，约90％的序列相似。TcdB结合的主要部位是结肠上皮细胞中表达的FZD1 / FZD2 / FZD7。尽管P. sordellii存在于肠道菌群中，但它不会感染破坏结肠上皮细胞。TcsL的宿主细胞受体尚不清楚。

近日，加拿大多伦多大学的Mikko Taipale团队在Cell 上发表了题为Recognition of Semaphorin Proteins by P. sordellii  Lethal Toxin Reveals Principles of Receptor  Specificity in Clostridial Toxins的文章。本研究采用了全基因组的CRISPR/Cas9筛选，发现SEMA6A和SEMA6B为TcsL的宿主细胞受体。

为了寻找TcsL的细胞表面受体，团队在Hap1细胞中使用TKOv3 gRNA文库进行了全基因组CRISPR/Cas9筛选，所用TcsL的剂量是0.1nM或者1nM。最终发现葡萄糖焦磷酸化酶2 （UDP-glucose pyrophosphorylase 2 UGP2）和SEMA6A（Semaphorin 6A）。虽然TcsL和TcdB序列高度相似，但是在筛查中并未筛选出TcdB的相关受体（Frizzled受体，CSPG4或PVRL3）。也没有筛选出产气荚膜梭菌或者艰难梭菌等的相关受体。接下来作者敲除了Hap1细胞中的UPG2和SEMA6A来验证筛选的结果。结果显示敲除了UGP2、SEMA2A的细胞对TcsL具有高度抵抗性。慢病毒转导SEM6A6A到SEMA6A-KO细胞中，则会恢复细胞对毒素的敏感。

SEMA6A是semaphorin蛋白家族成员，在人类中有二十种跨膜和分泌蛋白构成。SEMA6包括四个成员A-D。其中SEMA6A和SEMA6B序列相似性最高69%。作者构建了四种蛋白敲除的Hap1细胞分析发现SEMA6B-KO的细胞对TcsL的敏感性降低，虽幅度不如SEMA6A-KO细胞。SEMA6A/B双敲的细胞对TcsL抵抗性比单敲的明显升高。而不表达SEMA6A/B的HeLa细胞对TcsL具有高度抵抗。SEMA6C/D在Hela和Hap1细胞中表达也较低，于是作者用慢病毒异位表达四种蛋白到SEMA6A-KO中也验证了SEMA6A/B可以调控细胞对TcsL的敏感性。

接下来作者发现重组SEMA6A胞外域可以保护细胞和小鼠肺组织免受TcsL毒性损伤。作者表达纯化了SEMA6A的可溶性重组胞外域（recombinant extracellular domain rECD），利用表达SEMA6A不表达SEMA6B的Vero细胞测试了抵抗效果。作者发现SEMA6A rECD只有在TcsL加入之前或者同时加入才具有保护细胞的效果，并且存在剂量依赖性。如果用TcsL预处理细胞则失去保护效果。作者同时合成了其他三种SEMA6，也只有SEMA6B能够减轻TcsL毒性。因为索氏杆菌感染的主要靶标是肺血管内皮细胞。作者用永生化的人肺微血管细胞也得到了一致的结果。

为了体内验证SEMA6A rECD的效果，作者首先通过免疫组化检测了SEMA6A/B在小鼠肺组织的表达，发现二者均在肺内皮细胞和肺细胞中高表达。小鼠腹腔内注射致死剂量的TcsL和rSEMA6A-Fc、rSEMA6C-Fc或者BSA对照。rSEMA6A-Fc能够保护小鼠免受TcsL诱导的症状。这些实验表明SEMA6A/B是TcsL的生理相关受体，这种相互作用可以在体内被抑制。

作者接下来解析了TcsL1285-1804aa-SEMA6A复合物的冷冻电镜结构。作者发现TcsL与受体的结合并没有明显的构想改变。TcsL和SEMA6A在两个主要位点相互作用。而且TcsL与SEMA6A的结合界面也是SEMA6A的同源配体Plexin A2结合的位置。在TcsL-SEMA6A结构中，与TcsL相互作用的两个SEMA6A的氨基酸残基（Arg108 和 Ile193）和SEMA6B中的相同，但是在SEMA6C/D中不保守，与A/B不一样，这可能解释了TcsL结合受体的特异性。作者发现TcsL和TcdB通过相同的相互作用区域结合不同的宿主受体。接下来作者通过构建多种突变体证明了TcsL与受体结合的特异性。通过将受体结合界面的15个TcsL残基更改为TcdB中的残基，作者构建了具有TcdB样结合界面的TcsL结合结构域（FBD）1285–1804。作者发现这些突变足以变换TcsL结合的特异性: TcsL 1285-1804（FBD）可以与FZD7牢固结合，却不再与SEMA6A结合。

本研究鉴定了索氏梭菌毒素的人细胞受体SEMA6A/B，还阐明了梭菌毒素如何进化导致受体结合界面识别不同宿主受体的基本机制。这项研究有助于揭示索氏梭菌引起人类疾病的主要决定因素，为开发抑制梭菌细菌感染药物提供的理论支持和基本策略。

本研究曾于2019年12月10日上传在bioRxiv上。与2020年4月16日发表在Cell Host & Microbe上的一篇题为Genome-Wide CRISPR Screen Identifies Semaphorin 6A and 6B as Receptors for Paeniclostridium sordellii Toxin TcsL文章结论几乎完全一样（详见BioArt报道：董民团队发现索氏梭菌致死毒素TcsL的细胞受体）。