双靶点抑制剂的开发—具有CDK6和CDK9双重抑制活性药物的设计
细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，与多种参与细胞周期调控、表观遗传调控和其他增殖、分化相关的特异性细胞周期蛋白协同作用，在大多数癌症中都有发现CDKs的非正常激活或异常表达，是癌症发生的标志之一。
CDKs包含多种亚型，其中CDK4/6和cyclin D在乳腺癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌和白血病等多种肿瘤中都有过度激活的现象，针对CDK4/6靶点，辉瑞公司研发的palbociclib已于2015年2月被批准作为一线药物治疗ER阳性/HER2阴性乳腺癌（图1）。
此外，由诺华公司和礼来公司分别开发的CDK4/6抑制剂ribocilib和abemaciclib也被FDA批准用于乳腺癌的治疗。虽然这些药物都取得了良好的疗效，但常常会出现营养不良、贫血、乏力、腹泻等严重的不良反应，同时也出现较强的耐药性。
研究表明，肿瘤细胞对CDK4/6抑制剂产生耐药性的过程中往往伴随着CDK9的过度表达。目前CDK9也已被广泛认为是一种潜在的抗肿瘤靶点，抑制CDK9是治疗急性髓细胞性白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）的一种新的靶向治疗方法。因此，作者认为同时以CDK6和CDK9为靶点的小分子抑制剂不仅可以产生协同的抗癌活性，而且可以规避对CDK4/6抑制剂的耐药性。
图1 目前已经开发出的CDKs抑制剂
作者对其实验室现有的化合物库进行CDK2、CDK6和CDK9的酶抑制活性测定，初步确定了一种嘧啶二胺类化合物8（结构见图3）对CDK6和CDK9具有中度抑制作用（IC50：3.4308~6.6493 μM），但对CDK2的抑制作用很强（IC50：0.031 μM），并对多种细胞表现出良好的增殖抑制活性，是一个良好的先导化合物。
因此，为了设计出对CDK6和CDK9双靶点具有明显选择性且具有更高抑制活性的化合物，作者对该化合物进行下一步优化。
作者通过Discovery Studio将先导化合物8分别与CDK6和CDK9蛋白进行对接，探讨其对接模型与CDK6抑制剂palbociclib和CDK9抑制剂A86结合模式之间的差异。
如下图2所示，化合物8与CDK6（图2C）和CDK9（图2D）之间的相互作用类似于palbociclib和A86，2-氨基嘧啶分别与CDK6关键氨基酸Val101和CDK9的关键氨基酸Cys106形成氢键。化合物8的邻甲基苯基取代基类似于palbociclib的环戊基和A89的环丙基，占据了CDK6蛋白中Val27、Ile19和Asn150（图2E）或CDK9蛋白中Val33、Ile25和Phe30（图2F）形成的疏水口袋。然而，与palbociclib相比，化合物8与CDK6的亲水区并没有相互作用，但palbociclib的乙酰基会与亲水残基Asp163和Lys43会形成氢键。
此外，palbociclib的哌嗪环尽管暴露于蛋白口袋之外，但研究表明该基团是抑制CDK4/6的关键基团，可能具有其他不可忽视的潜在作用。虽然很少有CDK9抑制剂占据CDK9中由Asp167和Lys48形成的亲水区，但该区域仍然具有一定的结合潜力。
图2 （A）以palbociclib为代表的CDK6抑制剂的结合模式（PDB:5L2I）；
（B）以A86为代表的CDK9抑制剂的结合模式（PDB:6GZH）；
化合物8与CDK6（C）和CDK9（D）的对接模型；
化合物8与CDK6（E）和CDK9（F）对接模型的2D结合模式图。
根据以上模型结果，作者对化合物8进行了逐步修饰和构效关系研究，固定2-氨基密啶的骨架结构，主要针对A/B/C区域（图3）进行修饰。首先，作者将区域B的吡啶基团用苯基、苄基、苯乙基或其他杂环取代，发现了对CDK6蛋白具有更高抑制活性的化合物16（步骤1）。
为了得到与palbociclib中哌嗪环类似的作用，作者尝试在化合物16的吡啶环末端引入各种脂肪族杂环结构，发现引入N-甲基哌嗪的化合物23对CDK6/9的抑制活性明显提高（步骤2）。作者进一步探究A区苯基和嘧啶环之间的取代基对活性的影响，结果表明嘧啶和苯基之间引入长链基团对活性是不利的（步骤3）。因此，作者以化合物34为代表作进一步修饰。为了达到palbociclib的环戊基起到的相类似的效果，作者考察了疏水取代基在苯环上的位置和体积。
由于CDK9的疏水口袋相对较小，在苯环上再引入较大的基团只能增加对CDK6的抑制作用，而降低对CDK9的抑制作用。因此，考虑到两个靶点之间的平衡作用，根据CDK6/9蛋白结构，作者在苯环上引入乙酰氨基基团，该基团会与位于亲水区的CDK6关键残基Lys43/Asp163和CDK9的关键残基Lys48/Asp167相互作用，并合成了化合物66，发现其活性提高了近100倍（CDK6，IC50：0.0405 μM）和170倍（CDK9，IC50：0.0395 μM）（步骤4），并且对CDK2（IC50>10 μM）抑制活性低，具有良好的选择性。
图3 以化合物8为先导化合物进行结构优化
此外，针对离体活性表现优异的化合物66，还分别探究了其对细胞周期的影响，和相关信号通路的影响，进一步研究了小鼠的活体实验，探讨了化合物66对CDK6和CDK9的双重抑制作用机制，证明设计的该化合物具有很大的开发潜力。
作者通过Discovery Studio分子对接模块探讨了现有抑制剂和靶标的模型，利用对接模型进一步探究先导化合物的结合模式，并基于CDK6和CDK9两个靶点蛋白结构进行合理的药物设计，该研究思路利于往后更多多靶点的药物设计，值得我们学习。
全文完
分子模拟工作室
-Molecular_Simulation-
供稿：Jonzien
编辑：Xiuxiu
审核：Beicheng
投稿微信：lixiaobingxx
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