肠癌血浆DNA甲基化检测——数字PCR技术

文献分享

      结直肠癌早发现/早诊断可以大大降低患者死亡率。随着液态活检技术的迅速发展，癌症的早诊成为可能。液态活检的核心是找到高特异性/高敏感性疾病生物标志物（biomarker），通过检测/监控标志物的变化判断疾病发展进程。在这里，首先利用甲基化芯片进行结直肠癌DNA甲基化标志物筛选，然后利用数字PCR在血浆样本中进行标志物鉴定，最后确定了个三个高特异性/高敏感性结直肠癌DNA甲基化标志物。

1. 临床样本分析C9orf50，KCNQ5和CLIP甲基化与结直肠癌相关性。

2. C9orf50，KCNQ5和CLIP4甲基化与临床分期的关系。

3.TriMeth甲基化在结直肠癌中的灵敏性/特异性分析。

结果小结：

     C9orf50、KCNQ5和CLIP4基因甲基化水平在保证高度灵敏性和特异性的基础上，可以通过数字PCR在血浆样本中早期筛查结直肠癌。

数字PCR甲基化检测意义分析

DNA异常甲基化是肿瘤液态活检的重要诊断标志物。精准的诊断需要保证：

1）选择与癌症特异性/灵敏性高的肿瘤标志物；

2）选择适合液态活检的检测技术。

数字PCR甲基化检测解决方案

      数字PCR技术是一种单分子扩增技术。主要的优势包括：1）无需绘制标曲线，可以直接实现绝对定量；2）是目前基因检测方法中灵敏度最高的检测方法，更适合核酸含量较低的样本检测；3）较荧光定量PCR，结果更准确，更稳定；4）抑制因素对数字PCR扩增几乎没有影响，所以适合复杂样本的检测。

      Clarity芯片式数字PCR采用毛细管虹吸原理，保证DNA分子均匀分布至每根毛细管，实现DNA的单分子扩增，极大地促进DNA分子的扩增效率，保证了实验结果的稳定性和准确性。

     数字PCR检测包括：1）ctDNA核酸提取；2）重亚硫酸氢盐处理；3)配置15ul数字PCR反应液（与qPCR反应体系基本一致）；4）反应液分区至芯片中；5）PCR扩增；6）荧光信号检测，仪器判读核酸拷贝数（转化为甲基化率）

      数字PCR反应液配置前需要进行样本的简单稀释，保证检测浓度在仪器检测范围内（与qPCR一样cDNA或gDNA稀释后进行扩增，一般ctDNA不用稀释），数字PCR检范围：DNA拷贝数0-33600copies/15ul。

      数字PCR扩增程序与qPCR相同，最关键的退火温度，可根据引物和探针的Tm进行设置优化。

      数字PCR信号检测，仪器判读出的结果即核酸拷贝数（可转化为甲基化率），无需标准曲线绘制既可快速完成核酸绝对绝对定量。

      总之，数字PCR在检测血浆DNA甲基化时，具有更高的灵敏性和特异性。