撰文 | 木兰之枻
责编 | 兮
目前已知的人类致病遗传变异中,点突变约占58%【1】。近年来研究者通过开发单碱基编辑工具CBE(Cytosine Base Editor)和ABE(Adenine Base Editor)分别实现了C --T及A--G碱基的自由转换【2,3】,这对众多因碱基转换导致的遗传病研究及治疗有重要意义【3】(详见BioArt报道:突破丨Nature长文发表基因编辑最新成果——无需切割DNA也能自由替换ATGC)。除C--T和A--G碱基转换外,碱基颠换(C-A、C-G等等)在致病点突变中同样占很大比重,但针对此类突变的研究工具依然有限:传统的同源重组修复(HDR)需借助外源的DNA模板;2019年诞生的精准基因编辑工具引导编辑器PE (Prime Editors)的效果依然有待进一步验证。研究工具的不足极大的限制了相关研究的进行,因此开发可实现碱基颠换的单碱基编辑工具迫在眉睫。
2020年7月20日, Nature Biotechnology杂志背靠背在线发表中国科学院天津工业生物技术研究所张学礼和毕昌昊实验室合作的New base editors change C to A in bacteria and C to G in mammalian cells及哈佛医学院麻省总医院J. Keith Joung和Julian Grünewald实验室合作的CRISPR C-to-G base editors for inducing targeted DNA transversions in human cells研究论文。两篇文章在相同思路的指引下,通过改造现有的单碱基编辑工具CBE,构建出哺乳动物细胞适用的介导C-G碱基颠换的新工具GBE/CGBE。此外,张学礼和毕昌昊团队的文章还构建出微生物适用的介导C-A碱基对颠换的新工具。这一系列新工具的出现让单碱基编辑再添新武器,也为后续的基础研究和临床转化提供了新的助力。
早期研究发现,CBE系统除诱导C-T碱基转换外,特定条件下,如剔除融合蛋白中的尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)组分,CBE会诱导部分位点发生C-A和C-G碱基颠换(图1)。为此,文章一的研究者在两种野生型大肠杆菌菌株中对CBE工具之一nCas9-AID的单碱基编辑特性进行分析。结果显示,nCas9-AID可在大肠杆菌的八种不同位点处实现高效的C-T碱基转换和C-A碱基颠换(C-T和C-A突变的比例相似),但并不诱导C-G碱基颠换。后续的研究进一步证实,C-A碱基颠换的发生可归因于大肠杆菌中尿嘧啶DNA 糖基化酶(UNG)介导的DNA修复。
图1 胞嘧啶(C)脱氨基突变后的修复情况示意图
有鉴于此,为进一步改善nCas9-AID介导C-A碱基颠换的特异性,研究者构建出融合蛋白Ung-nCas9-AID并对其单碱基编辑能力进行检测。结果显示,在四种不同的位点处,Ung-nCas9-AID可高效且特异性的实现C-A碱基颠换突变。
在此思路的基础上,研究者对APOBEC为基础的CBE系统进行改造,构建出哺乳动物细胞适用的GBE系统APOBEC-nCas-Ung,可高效且特异性的介导目标区域C6位点处C-G碱基颠换。研究还指出,GBE系统诱导插入缺失突变(indel)的风险及脱靶风险均与CBE系统相近。
文章二的工作与上述哺乳动物细胞适用的GBE系统如出一辙,均是对APOBEC为基础的CBE系统进行改造,从而获得哺乳动物细胞适用的介导C-G碱基颠换的CGBE/GBE系统。所不同的是,研究者将原始的APOBEC替换为rAPOBEC1(R33A)突变体以降低工具在RNA和DNA水平的脱靶效应。由此获得的CGBE1系统可有效介导C-G碱基颠换。研究还发现,剔除融合蛋白中的eUNG组分获得的miniCGBE1依然保留着较高的C-G碱基编辑活性,但可有效降低工具indel的风险。研究还对CGBE与引导编辑器PE2/PE3的编辑效果进行比较分析,发现CGBE系统具有更高的编辑活性。
总体而言,两文开发的CGBE/GBE系统可在哺乳动物细胞中有效介导目标位点的C-G碱基颠换;文章一还开发出微生物可用的C-A碱基编辑系统UNG-nCas9-AID,该系统与已有的单碱基编辑系统CBE及ABE组合,理论上可实现目标碱基的任意替换。这一系列研究让单碱基编辑工具的开发进入新阶段。不过,我们也应注意到,哺乳动物细胞中依然难以实现C-A碱基颠换的编辑;且现有的CGBE/GBE系统的编辑效率和编辑特异性依然有待进一步提高,因此,单碱基编辑工具的开发和优化依然面临诸多挑战。
原文链接
https://doi.org/10.1038/s41587-020-0592-2
https://doi.org/10.1038/s41587-020-0609-x
制版人:琪酱
参考文献
1.Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing:precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat RevGenet (2018).
2.Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR.Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-strandedDNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).
3.Gaudelli, N.M. et al. Programmable baseediting of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471(2017).