专家点评Neuron | 郑斯卡团队揭示微小外显子microexon介导长寿神经元抗凋亡的特异性机制

细胞凋亡（Apoptosis）是在哺乳动物体内广泛存在的调控细胞更新和组织稳态的程序性细胞死亡方式。在大脑发育中，合理调控过剩的神经细胞发生凋亡对早期发育至关重要，但随着神经细胞分化成熟，细胞凋亡会被抑制以维持足量的神经元建立神经网络和完善大脑功能。目前，在神经系统疾病和致死性损伤中对如何激活神经元凋亡已进行了广泛的研究，但对如何抑制神经元凋亡研究有限，分子机制也尚不明确。

为了对这一问题进行探究，2020年7月24日，美国加州大学河滨分校郑斯卡研究组于Neuron杂志发表文章题为Developmental attenuation of neuronal apoptosis by neural specific splicing of Bak1 microexon，揭示了通过神经系统特异性剪接促凋亡因子Bak1的微外显子来减弱神经元凋亡活性，其对神经细胞和动物的生存发挥了至关重要的作用。

选择性的pre-mRNA剪接 （Alternative pre-mRNA splicing）可以从单基因位点产生多种mRNA亚型，是高等真核生物基因表达的重要调控机制。在哺乳动物的大脑中，这种剪接调控是普遍存在的【1,2】。神经发育（如轴突发生和突触发生）以及神经元活动等都需要多种RNA结合蛋白通过选择性剪接调控来形成其特定的转录组【3-6】。因此，为了研究选择性剪接是否是抑制神经元凋亡的重要因素，作者们采用已发表的成年小鼠RNA-seq数据比对了1,821个调控凋亡基因在神经组织和非神经组织之间选择性剪接的异同，同时利用小鼠胚胎发育期前脑和中脑的RNA-seq数据，找出了在发育期间差异性表达的外显子组。最终发现了一组神经组织特异性剪接且在发育期间差异性表达的外显子，其中包括Bak1第五外显子（图1C），一个只有20个核苷酸组成的微外显子。作者们利用毛细管定量电泳实验进一步证实Bak1第五外显子的选择性剪接在大脑皮层发育中的变化（图1D）。

图1: 神经元的存活与包括Bak1在内的调控凋亡基因的选择性剪接相关

无义介导的mRNA降解（Nonsense-mediatedmRNA decay, NMD）作为真核细胞中重要RNA监控机制，可有效识别并降解开放阅读框中含有提前终止密码子（premature termination codon, PTC）的mRNA，以避免因截短的蛋白产物积累对细胞造成毒害。对于BAK1 蛋白而言，它是由不含第五外显子并且终止密码子位于第七外显子的异构体（Bak1-E5^-）翻译产生的，而第五外显子的插入导致其开放阅读框的移位并在第六外显子产生一个PTC，使其包含第五外显子的异构体（Bak1-E5⁺）成为NMD的可能靶点（图2A）。为了证实这一推论，作者们利用Emx1-Cre在小鼠大脑皮质中特异性敲除NMD关键因子UPF2，进而有效地抑制NMD信号通路，然后在UPF2-cKO大脑皮质中检测Bak1-E5⁺和Bak1-E5^-的表达发现E5⁺在皮质发育的每个阶段都显著上调约6.6倍，而E5^-却没有明显变化（图2B）。这表明Bak1-E5⁺在Upf2条件性敲除模型中的显著上调是由于NMD信号通路的抑制，即它是NMD的靶点。另外，作者们发现人类BAK1也有一个20个核苷酸组成的外显子（第五外显子），与小鼠Bak1第五外显子几乎相同。并且人BAK1第五外显子绝大多数也存在于神经组织中，而在非神经组织中大量缺失。同时作者们还发现Bak1-E5⁺第六外显子上的PTC (UGA)在人及多种哺乳动物中高度保守，这表明其因在调控生命活动中具有重要作用而得以在物种进化中被保留。

图2: Bak1 exon5的选择性剪接导致其受NMD信号通路调控

图3: 杂合性缺失Bak1 exon5引起小鼠大脑中BAK1表达异常增高并导致新生小鼠死亡

由此，作者们提出了一个内源性神经元凋亡减弱模型（图4）：在神经细胞发育成熟过程中，通过AS-NMD调控来抑制BAK1蛋白表达水平，从内源性减弱了神经元的凋亡能力，从而支持神经元的持续存活。

图4: 内源性神经元凋亡减弱模式图

专家点评

张晓昌（芝加哥大学 助理教授）

作为感觉认知、思考和行为信息处理的最基本单位，绝大多数的神经元是伴随我们从出生到百年的。相比其他细胞类型，神经元为什么能如此长寿不衰？外在的刺激包括神经营养因子和突触间的信息传递被认为是神经元存活所必须的。迄今为止， 神经元是否拥有一个内在的系统抵抗衰老和凋亡尚且未知. 在这项研究中，Sika Zheng实验室报导了一个出乎意料的、由选择性RNA剪切介导的神经元抗凋亡机制，揭示了神经元长寿的内在特性。

选择性RNA剪切通过重排外显子增加RNA和蛋白质的多样性【10】。 有趣的是一类差异剪切的外显子可以引入提前终止密码子（premature stop codons），导致无意义mRNA降解 （nonsense mediated mRNA decay，AS-NMD) 从而降低基因表达水平【11】。AS-NMD 在进化上非常保守，目前对AS-NMD的认识主要集中在调节调控mRNA剪切因子的自稳态表达【12】。2012年, 郑斯卡等报导了在神经元生成过程中AS-NMD 动态调节PSD-95的现象和机制，开启了 AS-NMD在神经系统中的功能性研究【8,13】。人和小鼠的脑发育过程中存在被发现大量的保守的AS-NMD现象【14】。 我们和其他研究小组也相继发现内含子的非编码突变可以诱导异常AS-NMD，降低基因表达水平，进而造成人的神经发育疾病。尽管AS-NMD外显子非常保守， 迄今为止AS-NMD在正常哺乳动物体内是否有显著的生理学功能尚不清楚，而AS-NMD是否参与神经元抗衰老更是一个创造性的问题。

本研究通过对人和小鼠多个RNA测序数据集的挖掘，展示了细胞凋亡关键基因Bak1 在神经系统选择性的特异表达含微型外显子5 （microexon 5， E5）的剪切体。有趣的是，神经元表达的E5+剪切体引入提前终止密码子并造成无意义mRNA降解 (AS-NMD) ，从而显著降低甚至关闭了Bak1蛋白质在神经元中的表达。作者们进一步用CRISPR/Cas9在小鼠中敲除了Bak1 E5，发现在新生的杂合E5敲除鼠或因无法进食4天内致死。杂合E5敲除鼠中Bak1 E5- mRNA 和蛋白质水平显著上升， 在海马和皮层随之出现显著增加的凋亡细胞。这些结果显示了Bak1  E5 AS-NMD拥有可以决定动物生死的重要神经生理功能。通过CLIP-Seq和一系列分子实验，文中展示了Ptbp1直接结合并抑制Bak1 E5在非神经元细胞中的剪切，从而维持Bak1蛋白质表达；而在神经元中Ptbp1自身不表达，Bak1 E5+剪切增强， 从而抑制Bak1蛋白质表达和细胞凋亡。与此模型一致的是，当在皮层神经元中转入Ptbp1可以重新诱导Bak1蛋白质异位表达并诱导细胞凋亡。

该研究首次报导了神经元特异的抵御细胞凋亡的内在机制：通过转录后AS-NMD降低凋亡关键基因Bak1在神经元中的表达。该文首次用基因敲除小鼠展示了单个AS-NMD外显子在动物体内存在重要的生理学功能：虽然Bak1纯合敲除小鼠没有表型，而杂合的E5敲除鼠却因为Bak1 在神经元中异常表达造成新生致死。该项研究运用的RNA测序筛选和小鼠模型或将启发研究其它AS-NMD事件在神经系统和动物发育中的作用。

该项研究发现也激发一些思考：（1）正常衰老和神经退行性疾病都被认为与非正常mRNA剪切相关【15】，那么Bak1 E5 的剪切水平是不是参与正常神经元衰老和退行性疾病呢？ (2) Bak1 或相关凋亡基因的AS-NMD 是否存在于其他长寿的细胞，比如心肌细胞，以抵抗凋亡呢？ (3) 文中证据显示Ptbp1的表达可以维持正常的Bak1表达和细胞凋亡，或许可以部分解释Ptbp1敲除小鼠呈现出的致死性脑积水【16】。体外和体内实验支持 Ptbp1是抑制神经元命运的一个关键分子【17】，当前研究或许提示抵抗凋亡是诱导神经元生成的又一个关键因素。本文揭示了单个AS-NMD外显子在动物体内的重要功能， 革新了我们对神经元抗凋亡机制的认识，或将启发更多对AS-NMD 在体功能的相关研究。

专家点评

张朝林（哥伦比亚大学系统生物学系，生物化学分子生物物理学系 副教授）

对于大多数的体细胞而言，细胞凋亡 (cell senescence) 是控制细胞生长和数量的一种重要的调控机制。很显然，这种机制对于哺乳动物神经细胞而言是不合适的—因为神经细胞基本上是不可再生的。这就意味着它们需要存活很长的时间—基本于生物的寿命相同。否则，神经细胞的死亡缺失将破坏神经通路的正常功能，从而导致神经退行性疾病，比如老年痴呆、帕金森病以及冰桶挑战针对的渐冻人症。

那么，神经细胞又如何抑制在其它细胞中关键的细胞凋亡控制机制呢？UC Riverside 郑斯卡团队在Neuron杂志最近发表的文章中，他们发现微小外显子 (microexon)的神经特异性的可变剪接（alternative splicing），以及由此导致的细胞凋亡关键因子的降低是抑制神经细胞凋亡的一个关键的内在机制。

为研究神经细胞如何抑制细胞凋亡以及可变剪接在其中的作用，这项研究提出了两个假设。第一，如果一个可变剪接外显子在其中很重要，那么它的可变剪接形式是神经特异的。第二，由于神经前体细胞(NPC)的凋亡过程与其它体细胞类似，这个外显子的剪接形式会随细胞分化改变。基于这两个条件，团队分析了已知细胞凋亡相关基因在小鼠不同组织以及不同发育阶段在RNA-seq数据中显示的剪接形式。他们发现二十来个外显子符合设想的特征。

团队集中研究Bak1 微小外显子5。Bak1以及其同源基因BAX是已知促进细胞凋亡的关键因子。它们细胞发育及应急响应过程中感知上游的分子信号，激活后影响线粒体功能，从而引发细胞自杀机制。

Bak1 微小外显子5具有20个碱基。通常细胞表达的转录本不包含这个外显子，Bak1蛋白由此翻译产生。但是在神经细胞中，大部分的转录本包含这个外显子。虽然这段序列很短，但是后果却很严重。因为这个外显子剪接显然导致了翻译读码框的改变，从而引发了无义介导的mRNA降解(nonsense mediated mRNA decay, NMD)。所以在正常的神经细胞中，Bak1蛋白的表达量是很低的。这一点在所有的哺乳动物中似乎是保守的。

图1: Bak1 微小外显子5 剪接导致 NMD以及Bak1 蛋白在神经细胞中的表达量

图2: 利用CRISPR将Bak1 微小外显子5 删除后产生的Bak1DE5/+小鼠。由于包含微小外显子5减少，Bak1蛋白表达量大幅增高。

为了证明这个微小外显子在小鼠体内的功能，团队利用CRISPR基因编辑技术在小鼠中删除了这个外显子。这样，受影响的等位基因(allele)剪接时从理论上讲相当于所有的转录本都跳过了这个外显子，从而增加可翻译的转录本的表达量。对于Bak1^DE5/+小鼠脑组织的分析证明了这一点，不包含这个外显子的转录本增加了10倍左右。

图3: Bak1 DE5/+小鼠hippocampus 神经细胞凋亡显著增加。这些小鼠出生后四天内死亡。

接下来重要发现是，Bak1^DE5/+小鼠hippocampus 中CCK3+细胞比例增加了2-3倍。并且，这些细胞对于STS(staurosporine, 一种广泛使用于诱导细胞凋亡的药物)的响应也显著增加。这些证据表明由于Bak1蛋白的增加，神经细胞变得跟其它体细胞相似，受凋亡影响明显增加。而且这种影响只发生在神经细胞，而对于神经前体细胞并无改变。

这种在细胞层面的改变对于小鼠显然是关键的。事实上，Bak1^DE5/+小鼠出生后存活不超过4天。

图4: Bak1 微小外显子5受PTBP1调控。在神经细胞分化过程中，PTBP1表达量降低导致Bak1 微小外显子5剪接增加及Bak1蛋白减少，从而降低神经细胞的凋亡。

那么，接下来的问题是Bak1 微小外显子5在神经发育分化过程中是如何被调控的呢？团队发现，这个外显子剪接形式的变化发生在E12跟P2之间，跟神经细胞早期分化生成时间重合。根据以前的研究，在这个阶段一个很重要的剪接调控因子是PTBP1。通过一系列的体外实验证实，PTBP1直接结合微小外显子临近区域抑制其剪接。发育过程中，PTBP1在神经细胞中的表达量降低，从而导致的Bak1微小外显子5剪接的增加。PTBP1对于Bak1微小外显子5剪接的调控，以及神经细胞凋亡在小鼠体内的影响，也通过了PTBP1的高表达实验予以证实。

综合上述结果，本文揭示神经细胞通过在可变剪接层面有一个高度受调控的内在分子机制抑制细胞凋亡，从而保证神经细胞的长时间的存活及正常功能。这一点于以前研究中发现的神经细胞所在的环境的影响（比如神经营养因子）具有本质的不同。

扩大阅读：可变剪接是一种通过组合不同的外显子导致一个基因产生不同的变体的分子机制，在哺乳动物，尤其是在神经系统中尤其普遍。大规模测序以来，对于特定组织，细胞可变剪辑形式及调控的研究进展迅速，但是特定基因中可变剪接的功能研究目前是一个瓶颈。郑斯卡团队长期专注于可变剪辑对于神经系统功能的影响，这篇最新文章又是这方面的一项力作。

1.  Barbosa-Morais, N.L., Irimia, M., Pan, Q., Xiong,H.Y., Gueroussov, S., Lee, L.J., Slobodeniuc, V., Kutter, C., Watt, S., Colak,R., et al. (2012). The evolutionary landscape of alternative splicing invertebrate species. Science 338, 1587–1593.

2.  Merkin, J., Russell, C., Chen, P., and Burge, C.B.(2012). Evolutionary dynamics of gene and isoform regulation in Mammaliantissues. Science 338, 1593–1599.

3.  Furlanis, E., and Scheiffele, P. (2018). Regulationof Neuronal Differentiation, Function, and Plasticity by Alternative Splicing.Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 34, 451–469.

4.  Raj, B., and Blencowe, B.J. (2015). AlternativeSplicing in the Mammalian Nervous System: Recent Insights into Mechanisms andFunctional Roles. Neuron 87, 14–27.

5.  Vuong, C.K., Black, D.L., and Zheng, S. (2016). The neurogeneticsof alternative splicing. Nat. Rev. Neurosci.17, 265–281.

6.  Zheng, S. (2020). Alternative splicing programming ofaxon formation. Wiley Interdiscip. Rev. RNA e1585.

7.  McGlincy, N.J., and Smith, C.W.J. (2008). Alternativesplicing resulting in nonsense-mediated mRNA decay: what is the meaning ofnonsense? Trends Biochem. Sci. 33, 385–393.

8.  Zheng, S. (2016). Alternative splicing andnonsense-mediated mRNA decay enforce neural specific gene expression. Int. J.Dev. Neurosci.

9.  Zheng, S., and Black, D.L. (2013). Alternativepre-mRNA splicing in neurons: growing up and extending its reach. Trends Genet.29, 442–448.

10. Sharp, P. A. Split genes and RNA splicing. Cell 77, 805-815, doi:10.1016/0092-8674(94)90130-9 (1994).

11. Lewis, B. P., Green, R. E. & Brenner, S. E. Evidence for the widespread coupling of alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 189-192, doi:10.1073/pnas.0136770100 (2003).

12. Lareau, L. F., Inada, M., Green, R. E., Wengrod, J. C. & Brenner, S. E. Unproductive splicing of SR genes associated with highly conserved and ultraconserved DNA elements. Nature 446, 926-929, doi:10.1038/nature05676 (2007).

13. Zheng, S. et al. PSD-95 is post-transcriptionally repressed during early neural development by PTBP1 and PTBP2. Nat Neurosci 15, 381-388, S381, doi:10.1038/nn.3026 (2012).

14. Yan, Q. et al. Systematic discovery of regulated and conserved alternative exons in the mammalian brain reveals NMD modulating chromatin regulators. Proc Natl Acad Sci U S A 112, 3445-3450, doi:10.1073/pnas.1502849112 (2015).

15. Tollervey, J. R. et al. Analysis of alternative splicing associated with aging and neurodegeneration in the human brain. Genome Res 21, 1572-1582, doi:10.1101/gr.122226.111 (2011).

16. Shibasaki, T. et al. PTB deficiency causes the loss of adherens junctions in the dorsal telencephalon and leads to lethal hydrocephalus. Cereb Cortex 23, 1824-1835, doi:10.1093/cercor/bhs161 (2013).

17. Xue, Y. et al. Direct conversion of fibroblasts to neurons by reprogramming PTB-regulated microRNA circuits. Cell 152, 82-96, doi:10.1016/j.cell.2012.11.045 (2013).