一石二鸟！扁豆凝集素有效抑制流感和新冠病毒
新冠疫情在全球蔓延，然而与此同时其他病毒如流感等却丝毫没有减弱，同样应引起我们重视，是否能够开发出广谱抗病毒的药物来对抗呢？近日，国立阳明大学与香港研究院的研究者在国际期刊Cell Reports上发表研究论文，题为“A carbohydrate-binding protein from the edible Lablab beans effectively blocks the infections of influenza viruses and SARS-CoV-2 ”，研究者从扁豆(拉丁名：Lablab purpureus)中分离出一种凝集素，能够同时靶向多种亚型的流感毒株和新冠病毒，并深入探究了其抗病毒活性和分子机制，为病毒感染防治提供了新的思路。
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流感病毒感染每年造成全球超过50万人的死亡，目前治疗药物主要有有神经氨酸酶抑制剂、多聚酶抑制剂、M2蛋白抑制剂以及血凝素单克隆抗体，然而由于流感病毒的高频突变能力，耐药性限制了这些药物的继续使用。流感病毒在宿主细胞内会进行翻译后修饰，形成高甘露糖和杂合型糖链，不只是流感病毒，新冠病毒表面刺突蛋白也具有高度糖基化特征，这些糖基化在病毒入侵、免疫逃逸等过程发挥重要作用，而且糖基化类型受宿主限制，病毒很难改变，因此糖基化可能作为新的抗病毒药物靶标。
凝集素是一类特异性识别糖链的蛋白质，发挥天然抗病毒功效。目前已鉴定出红藻凝集素GRFT、蓝藻凝集素CVN、香蕉凝集素H84T等对于HIV、流感病毒和冠状病毒都有一定的抑制作用。然而目前尚未有实验探究凝集素对新冠病毒的抑制作用，发现新型凝集素对广谱抗病毒药物开发具有重要意义。
扁豆凝集素
研究者在筛选抗流感病毒的中药活性成分时，发现扁豆种子水提物对于4种流感疫苗毒株表现出广泛的中和活性。《本草纲目》中就提到扁豆增强免疫的功效，之前的研究也鉴定出扁豆中的活性成分。为了确定其中的抗病毒成分，研究者通过盐析法、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析一系列操作对提取物进行分级分离，筛选富集对H5N1具有最强微中和活性的组分，通过电泳发现为包含五种肽段的寡聚蛋白，质谱分析显示该蛋白质为扁豆凝集素（FRIL）。已有研究表明扁豆凝集素单体具有一个糖结合结构域，但在溶液中的状态未得到确定，综合利用多角度光散射、动态光散射、电镜复染，发现扁豆凝集素为四聚体结构。
扁豆组分中和活性及蛋白电泳
研究者进一步在体外定量测定了扁豆凝集素的抗病毒活性，空板减少试验与微中和试验显示PRNT50与EC50约0.7ug/Ml。利用11种流感毒株测定中和谱，发现除实验室菌株A，扁豆凝集素能以纳摩尔水平抑制不同亚型毒株。研究者通过鼻腔给药在小鼠体内评估凝集素的作用，凝集素抗病毒活性表现剂量依赖，高剂量给药能够明显延长存活时间甚至保护免受感染。
扁豆凝集素抗病毒活性
扁豆凝集素是已知的甘露糖/葡萄糖特异性凝集素，但关于扁豆凝集素与复杂糖基化的结合机制还有待了解。研究者将接种流感病毒的鸡胚进行α-甘露糖酶抑制剂并在回收时利用切割高甘露糖的内切糖苷酶处理，纯化后利用串联质谱、免疫印迹分析。结果发现扁豆凝集素主要结合流感病毒血凝素，而且主要结合复合型糖链而不是高甘露糖链，这与其他凝集素有很大不同。为了探明这现象背后的机制，研究者利用荧光探针标记的扁豆凝集素，发现与1,3或1,4岩藻糖基化N乙酰葡萄胺的复合型糖链结合最好。
凝集素结合糖链
研究者进一步分析了扁豆凝集素的抗病毒机制,竞争性微中和试验发现甲基甘露糖苷和葡萄糖能够抑制其中和作用，证实了抗病毒中和效应依赖于糖结合功能。细胞用扁豆凝集素、流感病毒依次分开处理，不能有效中和病毒感染，说明扁豆凝集素抑制病毒进入，必须直接结合病毒粒子才能发挥作用。流感病毒侵入细胞主要是吸附、内吞、脱壳、核转运这几个步骤，通过血凝抑制试验发现扁豆凝集素不能抑制病毒的吸附，研究者通过低温减慢病毒内吞入胞，使病毒吸附在细胞上，加入扁豆凝集素后观察到明显的中和效果，而在常温下病毒发生内吞后无法发挥作用，因此凝集素作用于吸附与内吞之间的过程。利用病毒核蛋白抗体免疫荧光示踪病毒入胞过程，发现凝集素处理组导致病毒滞留在核周区，通过内体/溶酶体染色显示病毒停留在晚期溶酶体内，凝集素在溶酶体仍能保持活性，可能发挥阻止病毒核转运的作用。进一步研究者发现核蛋白免疫荧光表现为大颗粒，且随着凝集素浓度增加颗粒逐渐变大，推测是凝集素与病毒颗粒间形成多价交联，聚集成团，从而发挥抗病毒作用。
凝集素抑制流感病毒的机制
研究者进一步分析了凝集素对新冠病毒的作用，无论是细胞病变还是空斑减少试验都显示了扁豆凝集素对新冠病毒的中和效力，多克隆抗体检测证实凝集素处理细胞病毒载量显著降低。但是扁豆凝集素对HIV无明显中和活性。ELISA结果表明扁豆凝集素能够以纳克水平结合刺突蛋白，特别是其上的复合型糖链。这与之前的研究新冠病毒刺突蛋白除两处位点，以复合型、杂合型糖基化为主。
凝集素对新冠刺突蛋白的抑制
该研究深入探究了凝集素的作用机制，揭示了扁豆凝集素独特的抗病毒分子机制，为天然产物抗病毒药物开发提供了新的思路。
文章来源：Cell Press
原文链接：https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(20)31001-9
本期编辑：Reynard Fox
审阅：Tony
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