ACS Chem. Biol. │ 新型MIC60抑制剂诱发β-catenin突变体依赖的细胞凋亡

供稿人：杨铭栋，北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chem. Biol. 的文章“Miclxin, a Novel MIC60 Inhibitor, Induces Apoptosis via Mitochondrial Stress in β-Catenin Mutant Tumor Cells”，文章来自庆应大学的Masaya Imoto课题组。在这篇文章中，作者发展了可以特异性靶向MIC60的小分子抑制剂，该抑制剂可以引发含β-catenin突变的肿瘤细胞的凋亡。

β-catenin是Wnt信号通路的重要组分，在其中发挥着十分重要的作用。在缺乏Wnt配体时，β-catenin上多个位点发生磷酸化，进而引发泛素化依赖的蛋白降解；而Wnt信号通路一旦被激活，β-catenin会被稳定并转运进核内，之后通过结合T-cell factor激活靶向基因的转录。目前，β-catenin的突变已在多种肿瘤细胞中被发现；且突变导致的β-catenin核内定位又与较短的生存时间显著相关，可见β-catenin是一种潜在的抗肿瘤治疗靶点。尽管如此，目前还没有发现任何有潜力的药物来靶向含有β-catenin突变的肿瘤。因此，本文旨在开发可以特异性针对β-catenin突变型癌细胞的小分子药物。

作者首先对含25000多个化合物的小分子库进行筛选，得到了6个可以特异性诱导β-catenin突变型HCT116细胞凋亡的小分子(图1A)。其中，仅DS37262926一种化合物在β-catenin敲低的细胞系中失去了作用(图1B)。作者将该化合物命名为Miclxin，从图中可以看出，该化合物可以以剂量依赖的方式诱导细胞死亡(图1C、D)。之后，作者又在野生型β-catenin敲除的HCT116(CTNNB1 Δ45/−)及突变型β-catenin敲低的HCT116(CTNNB1 +/−)中对Miclxin进行了表征。从图中可以看出，Miclxin仅对野生型敲低的细胞产生作用，说明该化合物功能的发挥依赖于β-catenin突变体的存在(图1E)。

图1. 小分子的筛选及表征。A. 小分子筛选的流程；B. Miclxin分子结构；C. Miclxin对β-catenin敲除细胞的效果表征；D. Miclxin生长抑制曲线；E. Miclxin特异性靶向β-catenin突变型细胞。

为了鉴定Miclxin在细胞内的作用靶点，作者通过光交联的方式将Miclxin固定到了微球上，以此实现对细胞内靶标蛋白的富集。通过质谱和细胞热转变分析，作者发现该化合物的靶点是MIC60(图2A、B)。通过体外结合实验，作者发现Miclxin可以与MIC60的N端结合，且解离常数为11.9 μM(图2C、D)。

图2. Miclxin细胞内靶点的鉴定。A. Miclxin微球的细胞内富集(银染)；B. 体内靶点的验证(细胞热转变分析)；C. Miclxin 与MIC60结合结构域的确认；D. Miclxin与MIC60解离常数的检测(SPR)。

MIC60是MICOS复合物的重要组成部分，在线粒体结构、功能及稳态的维持中都发挥着十分重要的作用。从图中可以看出，Miclxin可以抑制MIC60的功能，并导致线粒体膜电位的丢失和ROS的产生；此外，在MIC60敲低的HCT116细胞中，作者也观察到了同样的效果(图3A、B)。Miclxin还会导致eIF2α磷酸化、ATF4及CHOP表达的上调，表明其可以诱发线粒体应激反应(图3C)。

图3. Miclxin抑制MIC60功能并诱导线粒体应激反应。A. Miclxin对线粒体膜电位的影响；B. Miclxin导致ROS产生的增加；C. Miclxin诱导线粒体应激反应。

之后，为表征线粒体应激在线粒体损害中的作用，作者测试了CHOP敲低对线粒体膜电位的影响。从图中可以看出，Miclxin造成的早期(12h)膜电位丢失在CHOP敲低细胞及对照细胞中都可以被观察到；但在后期(24h)，对照细胞存在膜电位的进一步丢失，而CHOP敲低细胞则没有(图4A)。该现象说明，Miclxin介导的膜电位丢失可以分为两个阶段。Miclxin对MIC60的抑制作用导致早期的膜电位丢失；而线粒体应激条件下CHOP表达的上调则导致后期膜电位丢失。此外，CHOP表达的上调可以引起Bcl-2表达的下调(图4B)。Bcl-2是已知的抗凋亡蛋白，可以抑制膜电位丢失，说明Bcl-2的下调可能是后期膜电位丢失的重要原因。为进一步研究Miclxin导致细胞死亡的原因，作者对多种细胞死亡方式的抑制剂进行了检测。从图中可以看出，Miclxin诱导的细胞死亡，并非caspase依赖的凋亡、坏死或铁死亡(图4C)，而是AIF依赖的凋亡(图4D)。在Miclxin诱导下，AIF会从线粒体膜间质通过细胞质转运进核内(图4E)，通过诱导染色质聚集和DNA片段化引发细胞凋亡；而当敲低CHOP时，该效应消失(图4F)。

图4. 线粒体应激反应的作用及Miclxin引发的细胞死亡方式。A. Miclxin引发两个阶段的膜电位丢失；B. CHOP过表达导致Bcl-2的降解；C/D/E. Miclxin诱导AIF依赖的细胞凋亡；F. CHOP敲低消除AIF依赖的细胞凋亡。

最后，作者探究了β-catenin在上述过程中的作用。从图中可以看出，β-catenin的敲低并不能抑制Miclxin引发的早期膜电位丢失，但对后期膜电位的丢失有抑制效果(图5A)。此外，β-catenin的敲低还会抑制该过程中ATF4的核内积累和CHOP表达的上调(图5B)，说明β-catenin在诱导后期线粒体膜电位丢失的过程中发挥着重要作用。

图5. β-catenin在Miclxin诱导的细胞死亡中的作用。A. β-catenin敲低抑制后期膜电位的丢失，而不影响前期膜电位丢失。B. β-catenin敲低抑制ATF4的核内积累及CHOP的表达。

综上，作者开发了靶向MIC60的新型小分子Miclxin。该分子可以在β-catenin突变型细胞中引发Bcl-2表达的下调，进而导致AIF依赖的细胞凋亡(图6)。此外，该文章表明MIC60可能是携带β-catenin突变的肿瘤细胞的潜在治疗靶点。

图6. Miclxin诱发β-catenin突变体依赖的细胞凋亡。

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ACS Chem. Biol. 2020, ASAP

Publication Date: June 25, 2020

https://doi.org/10.1021/acschembio.0c00381

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