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预印本在线期刊BioRxiv发表了来自俄罗斯科学院/美国加州理工学院的Alexei A. Aravin课题组题为“Programmable DNA cleavage by Ago nucleases from mesophilic bacteria Clostridium butyricum and Limnothrix rosea 的研究论文。该研究报道了来自嗜温细菌类的Clostridium butyricum (CbAgo) 和 Limnothrix rosea (LrAgo)的两种Argonautes蛋白，在生理温度37摄氏度体外具有剪切双链DNA的的活性。该研究为寻找能够在中等温度下切割dsDNA的原核Ago作为基因编辑的工具开辟了新的道路。Argonaute蛋白是真核RNA干扰机制的核心组成部分。它们结合小非编码RNA形成沉默复合体（RISC）,进行切割或阻止靶向mRNA的翻译，或者介导染色质上表观遗传的改变使基因沉默。然而在细菌和古细菌基因组中也发现了Argonaute蛋白。研究表明，一些原核生物Ago（pAgo）蛋白在体外具有核酸内切酶的作用，并且在体内能对外来遗传元件进行沉默。因此，pAgos是细菌作为对侵入性遗传元件起作用的先天免疫系统，与CRISPR/Cas9系统有类似功能。大多数pAgos结合单链DNA（ssDNA）指导作用，包括AaAgo，AfAgo，TtAgo，PfAgo和MjAgo。其中pAgos中一些成员使用单链DNA能介导靶向DNA起作用，而不是RNA，尽管pAgos蛋白中缺乏内在的解旋酶活性。另外多数pAgos具有核酸内切酶活性的PIWI结构域，它们能在引导链的5'-末端开始的第十和第十一个核苷酸之间切割互补靶标DNA。与具有两个不同内切核酸酶结构域的Cas9蛋白能同时切割dsDNA的两条链相比，pAgos仅具有一个活性位点，只能在一条DNA链被一个沉默复合体切割。 因此，pAgos可能被用作体外和体内DNA操作的工具，包括分子克隆和基因组编辑应用。
早在2014年，Nature杂志在线发表了来自荷兰瓦赫宁根大学John van der Oost课题组题为“DNA-guided DNA interference by a prokaryotic
Argonaute”的研究论文，该研究首次报道来自Thermus thermophilus中的Ago蛋白TtAgo能够线性化或者nick质粒，产生线性或者开的环状DNA，并且如果同时表达两条guide ssDNA，可以高效的线性化质粒。同时，TtAgo蛋白是强烈的依赖于温度，ssDNA对于的切割温度是>20度，而质粒DNA的切割温度需要 >=65度。研究表明具有催化活性pAgos衍生自嗜热物种并且在升高的温度下起作用，因为温度升高后，双链DNA可能会部分解链。因此，由于它们不能解开dsDNA，尚不清楚pAgos是否能够在没有额外配偶体的情况下在中等温度下处理dsDNA底物。论文链接：doi:10.1038/nature12971
2016年5月2日，Nature Biotechnology在线发表了来自河北科技大学韩春雨课题组题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium
gregoryi Argonaute”的论文，该论文声称来源于Ntronobacterium gregoryi的Ago蛋白NgAgo-gDNA系统可以在生理温度37摄氏度进行有效的基因编辑。该文章一经发表，许多实验室进行了跟进，发现未能重复其结果。在2016年11月，由国内外二十家实验室负责人联名撰写的一篇名为“Questions about NgAgo”的文章在Protein Cell杂志上发表，提出无法重复韩春雨的NgAgo实验（论文链接：https://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2Fs13238-016-0343-9.pdf）。直至2017年8月3日，《Nature Biotechnology》发表题为《Time for the data to speak（是该数据说话的时候了）》社论，并宣布撤回韩春雨团队于2016年5月2日发表在该期刊的论文。因此，NgAgo蛋白不能在常温下进行基因编辑！
我们今天要介绍的这篇文章的通讯作者来自俄罗斯科学院/美国加州理工学院的Alexei A. Aravin课题组，该课题组在RNA研究领域和原核AGO蛋白的功能研究中取得一系列的进展！其中，该课题组在2013年的Molecular Cell杂志上在线发表了“Bacterial Argonaute Samples the Transcriptome to Identify Foreign DNA”的研究论文，该研究首次发现来源于细菌Rhodobacter sphaeroides中的Argonaute（RsAgo）不仅与15-19nt的RNA相关联，还结合单链22-24nt DNA分子后降解质粒DNA并抑制质粒编码基因的表达，这也说明该课题组也是该领域研究的领先者。
在该研究中，研究者发现来自嗜温原核生物的两种Argonaute蛋白，Bacillus C. butyricum(CbAgo)和cyanobacterium L. rosea (LrAgo)，研究发现这两种蛋白都是DNA引导的DNA核酸酶，其功能比迄今为止研究的其他pAgos低得多的温度下发挥作用。此外，该研究还揭示了两种ago蛋白都能利用5-端磷酸ssDNA和5'-OH DNA在37摄氏度进行切割DNA(如下图)。但是5'-OH DNA与相同序列的5'-P指导相比，反应速率略低，并且当LrAgo加载5'-OH DNA指导时，在规范位点上游1-2个核苷酸处观察到目标切割（下图B）。接下来，该研究发现了seed区域中的错配对CbAgo的切割效率几乎没有影响（见下图），并且对LrAgo来说还显著增加了靶切割。在补充区域中，切割位点下游的错配显着降低了CbAgo和LrAgo的靶切割效率。但在切割位点（10-11）的错配导致LrAgo靶标切割的强烈降低。然而，在CbAgo的情况下，位置11的错配对切割没有显着影响，而位置10的错配使切割位点移动一个核苷酸更接近导向5'末端。
虽然CbAgo和LrAgo可以切割ssDNA底物，但是dsDNA的切割是否可以？因为必须解开dsDNA双链体，然而pAgos没有解旋酶结构域。该研究显示CbAgo和LrAgo以独立于引导DNA的方式处理双链质粒DNA（即'chopping'活性），产生小的DNA片段，可以进一步加载到pAgos中并用作随后靶标切割的指导。但是CbAgo在装载了DNA后，'chopping'活性得到抑制（见下图），因此使其成为靶向DNA切割的更好候选者！最后，最为重要的是，研究表明通过将质粒与载有两对引导分子的CbAgo一起温育后，研究在55摄氏度下，CbAgo能高效将质粒DNA切割成两个线性分子，其大小对应于引导DNA靶向的位点（图6C）。因此，CbAgo通过独立切割每条DNA链进行dsDNA切割，这与限制性内切核酸酶或Cas9核酸酶类似，但却没有严格的序列要求。综上所述，该研究发现CbAgo可以在更低的温度下靶向特定的DNA位点，在37°C时效率低，在55°C时效率很高。现在明显的应用是在重组DNA技术中使用CbAgo，类似于限制性内切核酸酶，能靶向任何感兴趣位点，产生任何“粘性”末端。此外，与Cas核酸酶相反，CbAgo具有不需要PAM, 也不需要较长sgRNA的优势。但是，最为重要的问题是，如何让CbAgo体系能在细胞内进行基因组有效靶向，进行基因编辑？但是该研究也为我们指明了方向，因此，通过研究嗜温细菌中的pAgos进行体内DNA编辑及其对各种细胞活性的调控将是未来研究的重要目标！同时该文现在发表在预印杂志上，没有经过同行评审，期待更多的实验室能够重复该结果。论文链接：https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2019/02/22/558684.full.pdf注：由于该文报道的论文还在预印杂志上，该文未经允许谢绝公众号转载，以避免产生与本文不实的信息！![]()
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