【文献解读】APOE影响阿尔茨海默病新机制—脑脂质代谢差异

导 语

     载脂蛋白E（apoE）是脑内脂质的主要载体。它主要由星形胶质细胞和小胶质细胞分泌，并通过载脂蛋白E受体向接受载脂蛋白E结合物的神经元传递必需的脂质。相关研究显示ApoE4是阿尔茨海默病（AD）最重要的遗传危险因子。关于载脂蛋白E影响大脑的健康有很多科学假设但仍然不清楚。此前研究发现脂蛋白受体sortilin是神经元体外和体内摄取含apoE脂蛋白的主要内吞途径。尽管如此，区分apoE3和apoE4在脑脂质稳态和AD进程中的功能的机制仍存不清楚。

     近期，德国柏林马克斯-德尔布鲁克分子医学中心团队在《Alzheimer's & Dementia》（IF 17.127）杂志发表题为“Apolipoprotein E4 disrupts the neuroprotective action of sortilin in neuronal lipid metabolism and endocannabinoid signaling”的文章，将患者标本中的神经脂质组学与小鼠模型中的功能研究相结合，探讨了sortilin在脑脂质代谢和AD中的apoE亚型中的功能差异。

      已有研究发现在小鼠中编码sortilin的基因Sort1失活会导致小鼠apoE的脑积聚。小鼠apoE的积累与受体小鼠脑内Aβ肽水平的增加相一致。尽管这些发现提示了sortilin可能是AD相关过程中的一种apoE受体，但没有阐明这种受体与表达apoE4的人相比与apoE3相比与AD风险的相关性。为了证实Sortilin受体在大脑中的作用，作者将Sort1缺陷（KO）引入小鼠载脂蛋白E基因靶向替换的小鼠体内，该基因编码人类载脂蛋白apoE3（E3KO）或 apoE4（E4KO）。结果发现，与WT相比，KO小鼠皮质和海马中sortilin的丢失也导致了人类apoE3和apoE4的积累。而Sortilin缺乏并不影响大脑中apoE3或apoE4的转录水平，也不影响E3KO或E4KO小鼠的原代星形胶质细胞中apoE3和apoE4蛋白和转录水平。 因此Sortilin敲除小鼠脑中人类apoE3和apoE4水平的增加很可能是由于神经元清除功能受损，而不是由于星形胶质细胞产生的载脂蛋白增加所致。这些发现提示sortilin是小鼠和人类apoE变异体的主要脑清除受体。

图1 Sortilin缺乏导致apoE3和apoE4在大脑中积累

      接下来，作者使用基于LC-MS的脂质组学来确定 E3 KO和 E4KO小鼠大脑皮质中各种脂质水平。作者观察到与野生型相比，apoE不同基因型对脑内总FA和ω-3PUFA的水平有显著影响。与野生型小鼠相比，E3KO小鼠脑中的FA和ω-3PUFA水平较低。相比之下，与WT小鼠相比，无论是否存在sortilin，在E4小鼠脑中FA和ω-3PUFA水平始终较低。Sort1和APOE在控制脑脂质中的这种相关性在ω-3PUFAs比较明显，但在ω-6PUFAs则不显著，这以结果也与ω-3PUFAs在AD中的神经保护作用一致。

      为了阐明sortilin和apoE3与脑内多不饱和脂肪酸代谢的相关性，作者测定了这四种小鼠品系大脑中生物活性多不饱和脂肪酸衍生物的水平， 并重点研究了 eCB，一种由神经元中的多不饱和脂肪酸（PUFAs）产生的基于脂质的神经递质。大多数eCB具有抗炎和神经保护作用，eCB水平的改变往往与AD有关。结果发现eCB 中的几种主要物质anandamide和LEA不受基因型的影响，OEA和PEA在sortilin缺乏小鼠中降低，但与APOE基因型无关。此外，生理2-AG水平在WT小鼠中较低，但在E3KO小鼠中升高。相比之下，无论Sort1基因型如何，E4小鼠的2-AG水平始终高于WT小鼠。synaptamide则相反，生理水平在WT小鼠中较高，但在所有其他基因型组合中都较低。

      在APOEε3或APOEε4纯合子AD患者的脑标本中证实了eCB水平对APOE基因型的依赖性（图3）。与载脂蛋白eε3/ε3携带者相比，载脂蛋白eε4/ε4的突触胺水平较低，而2-Ag的水平则趋于较高。APOEε4/ε4基因型的anandamide水平也降低了（P<0.05），而OEA、LEA和PEA水平没有受到影响。

    eCB通过G蛋白偶联的cannabinoid受体CB1和CB2或作为PPARs的配体发挥作用。由于synaptamide不参与CB1/2，作者通过关注PPARs来探讨sortilin和apoE3相互作用在eCB代谢中的相关性。作者使用基于微阵列的策略来评估84个PPAR靶基因的转录水平，发现有12种脑转录物显示出对Sort1和APOE的依赖，与其他三个基因型相比，WT中的转录水平较高或较低。受影响的转录物包括PPARγ(Pparg)和视黄醇X受体(Rxrg),它们与PPARs形成异二聚体。使用qRT-PCR检测PPAR靶点Pparg、Mmp9和Klf10，作者证实了sortilin对E3中eCB依赖性基因转录的影响，但在E4小鼠中没有受影响。与Sort1和APOEε3在促进PPAR活性方面的相互作用一致，apoE3小鼠中sortilin的丢失或apoE4的存在（与Sort1基因型无关）导致小鼠大脑中与促炎状态一致的改变。

      为了探讨sortilin和apoE对PUFA进入大脑的影响，我们对脑组织、血浆和脑脂蛋白中的脂质水平进行了量化。作者发现Sort1或APOE基因型不影响2-AG和突触酰胺神经元代谢中酶的转录水平。因此，作者提出假设：apoE4可能会破坏sortilin的活性，使E4的大脑中的sortilin基本耗尽。这一假设是基于apoE4倾向于损害细胞内的分选，从而影响一些细胞表面受体的活性。为了探究受体运输（而非结合）是否受到apoE变体的不同影响，作者采用邻近连接分析法（PLA）检测了sortilin和apoE3或apoE4在CHO细胞中的共定位。结果显示，在整个细胞质中以分散的囊泡模式观察到sortilin与apoE3的共定位，而与apoE4的共定位则显示靠近细胞膜。通过与转移蛋白（Tf）共免疫染色PLA信号，可以证实复合到apoE4的sortilin的改变位置。与apoE4相比，sortilin/apoE复合物（PLA信号）与Tf的共定位程度显著高于apoE3。这些发现表明sortilin和apoE4复合物在内吞和/或再循环室中的滞留时间延长。

      为了进一步证实apoE4对sortilin分类的不同影响，作者通过用抗体标记细胞表面的sortilin分子，并使用免疫细胞化学方法遵循其随后的细胞内路径，建立了细胞内受体的运输路径。为了研究这些内化受体的循环，作者随后用内吞抑制剂dynasore处理细胞，以阻止循环的受体重新进入细胞。dynasore的使用导致标记的sortilin分子在质膜上积聚，证实了细胞表面内化（抗体标记）受体的细胞表面再循环。但dynasore的应用没有改变sortilin的表达水平。结果显示，在CHO细胞中建立的sortilin循环路径不受培养基中apoE3的影响。然而，在apoE4存在的情况下，内化的受体不能重新出现在细胞表面，而主要停留在细胞内。为了更准确地量化apoE3与apoE4存在时sortilin循环的程度，我们将CHO细胞表面的sortilin分子生物素化，并跟踪其内部化和再循环的命运，与经apoE3处理的细胞相比，经apoE4处理的细胞再循环回细胞表面的受体数量减少了50％。

该研究提示sortilin和apoE3在促进多不饱和脂肪酸（PUFAs）的神经元代谢为内源性大麻素（ecb）的过程中的独特作用。sortilin维持神经保护性eCB信号的能力被apoE4的结合所破坏，增加了促炎性标记物，为apoE4是AD风险因素提供了新的机制解读。

审 校 / 蔡玉洁