浙大 ACS Nano：180度大反转！改变自噬作用提高对乏氧肿瘤的光动力治疗

原创 CQR 材料人

【背景介绍】

光动力治疗（PDT）是一种用于许多局部和表面疾病的非侵袭治疗新方法。在PDT过程中，会产生具有细胞毒性的活性氧（ROS）来诱导细胞凋亡。同时，ROS也是自噬的重要诱因。其实，自噬是一种分解代谢过程，通过溶酶体途径降解功能失调或有害的细胞器和蛋白质。但是，过度的激活自噬会导致自噬细胞死亡。因此，自噬与细胞凋亡之间的串扰对PDT的治疗效果有重要影响。然而，利用自噬抑制剂来完全抑制自噬非常困难。因此，合理设计纳米材料来调控自噬从促生存变成促死亡，将是PDT中一个有意义的研究方向。众所周知，缺氧是许多实体瘤的显着特征。因此，如何缓解肿瘤缺氧是PDT的重中之重。目前，大多数研究集中在通过将H₂O₂分解为O₂或直接输送O₂来增加O₂的供应。其实，通过减少生理O₂的消耗也是一种缓解肿瘤缺氧的方法。但是，如何通过抑制O₂的消耗来缓解肿瘤缺氧的方法仍未得到充分的探索。

【成果简介】

近日，浙江大学的金桥副教授（通讯作者）和计剑教授等人报道了一种新型的超分子纳米平台，通过将自噬的作用从促进生存转变为促进死亡来增强PDT。利用呼吸抑制剂3-溴丙酮酸（3BP）作为自噬启动因子和缺氧改善剂，将其整合到光敏剂Chlorin e6（Ce6）包裹的纳米颗粒中，以对抗缺氧肿瘤。其中，3BP通过下调HK-II和GAPDH的表达来抑制呼吸作用，从而显着降低细胞内耗氧率，以减轻肿瘤的缺氧而增强PDT。更重要的是，通过Western印迹、免疫荧光成像和透射电子显微镜（TEM）测定，发现3BP和PDT的结合显著提高了自噬的水平。过度激活的自噬作用促进了细胞的凋亡，因此结合3BP的PDT可以有效抑制细胞增殖，同时杀死肿瘤。此外，通过3BP减轻肿瘤缺氧后，可降低缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达，进而通过消除原发肿瘤和下调HIF-1α表达来有效抑制肿瘤的转移。总之，这些结果为未来的癌症治疗创新方法提供了新思路。研究成果以题为“3-Bromopyruvate-Conjugated Nanoplatform-Induced Pro-Death Autophagy for Enhanced Photodynamic Therapy against Hypoxic Tumor”发布在国际著名期刊ACS Nano上。

【图文解读】

图一、CD-Ce6-3BP NPs和CD-Ce6 NPs的表征

（A）具有不同质量比的3BP与Ce6的CD-Ce6-3BP NPs的粒径尺寸；

（B）CD-Ce6-3BP NPs和CD-Ce6 NPs的Dh和TEM图像；

（C）在储存10 d期间，PBS缓冲液中不同纳米颗粒的Dh；

（D）利用660 nm照射处理或pH=5.5溶液处理4 h后，CD-Ce6-3BP NPs的D_h变化。

图二、糖酵解抑制、O₂消耗减少和CD-Ce6-3BP NPs的体外细胞毒性促进作用

（A）KB细胞与不同处理孵育6 h后，Western blot检测HK-II、GAPDH和HIF-1α的水平；

（B）KB细胞与不同处理孵育6 h后，定量分析HK-Ⅱ的相对表达；

（C）KB细胞与不同处理孵育6 h后，定量分析GAPDH的相对表达；

（D）KB细胞与CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs孵育6 h后，细胞内乳酸水平；

（E）KB细胞与CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs孵育6 h后，细胞内ATP水平；

（F）用不同处理孵育6 h后，KB细胞的耗氧量；

（G）KB细胞与不同处理孵育6 h后，定量分析HIF-1α的相对表达；

（H）用CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L、CD-Ce6-3BP NPs/L、游离3BP或CD-3BP处理后，KB细胞的存活率；

（I）不同处理后，利用荧光探针检测的细胞毒性。

图三、CD-Ce6-3BP NPs的自噬作用促进细胞死亡

（A）CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L、CD-Ce6-3BP NPs/L、游离3BP或CD-3BP处理KB细胞6 h后，Western blot 检测LC3-I、LC3-II和p62的水平；

（B）不同处理后，定量分析LC3-II/LC3-I；

（C）不同处理后，定量分析p62的相对表达；

（D）有无激光照射1 min的情况下，用CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs处理KB细胞4 h后，代表性LC3点状点的免疫荧光图像；

（E）有无激光照射1 min的情况下，用CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs处理KB细胞4 h后，MDC染色的荧光图像；

（F）有无激光照射1 min的情况下，用CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs处理KB细胞4 h后，形成自噬体的TEM图；

（G）（F）中放大倍数的TEM图像；

（H）在存在RAPA或3-MA的情况下，用CD-Ce6 NPs/L或CD-Ce6-3BP NPs/L处理后，KB细胞的存活率；

（I）不同处理后，利用荧光探针检测的细胞毒性。

图四、CD-Ce6-3BP NPs增加凋亡水平

（A）用CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L、CDCe6-3BP NPs/L、游离3BP或CD-3BP处理KB细胞6 h后，Western blot检测caspase 3的表达；

（B）利用Annexin V-FITC和PI分析法对CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L或CD-Ce6-3BP NPs/L处理KB细胞后，对凋亡细胞进行流式细胞术分析。

图五、对皮下肿瘤进行体内抗肿瘤、自噬和凋亡水平评估

（A）游离Ce6、CD-Ce6和CD-Ce6-3BP NPs的药代动力学特征；

（B）缺氧和血管染色后肿瘤切片的代表性免疫荧光图像；

（C）CD-Ce6 NPs或CD-Ce6-3BP NPs处理后，Western blot检测小鼠肿瘤组织中HIF-1α的水平；

（D）根据（C）的小鼠肿瘤组织，定量分析HIF-1α的相对表达；

（E）KB皮下肿瘤接种、给药治疗方案示意图；

（F）PBS、CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CDCe6 NPs/L和CD-Ce6-3BP NPs/L处理后，带有皮下KB肿瘤的裸鼠的肿瘤生长曲线；

（G）每只患有皮下KB肿瘤的小鼠的肿瘤重量；

（H）不同处理后，Western blot检测小鼠肿瘤组织中LC3-Ⅰ、LC3-II、p62和caspase 3的水平；

（I）PBS、CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L和CDCe6-3BP NPs/L处理后，小鼠肿瘤组织中LC3的代表性免疫荧光图像。

图六、原位4T1乳腺癌的治疗及其对肺转移的抑制作用

（A）肺转移治疗4T1原位乳腺肿瘤的接种和给药治疗方案示意图；

（B）PBS、CD-Ce6 NPs、CD-Ce6-3BP NPs、CD-Ce6 NPs/L和CD-Ce6-3BP NPs/L处理KB肿瘤裸鼠后的肿瘤生长曲线；

（C）每只患有原位4T1乳腺肿瘤的小鼠的肿瘤重量；

（D）注射后21 d后，从小鼠收获的原位肿瘤的肿瘤图像；

（E）4T1肺转移小鼠的生物发光成像照片；

（F）处理21 d后，肺部的生物发光成像照片；

（G）各组肺的生物发光强度；

（H）每组肺表面上存在的肿瘤结节的数目；

（I）各组肺中的肿瘤覆盖率；

（J）从各组切下的肺的代表性图像；

（K）H＆E染色后，各组肺组织转移灶的组织学检查。

图七、基因表达分析

（A）全基因表达的热图；

（B）与自噬表达相关的15个关键基因分析的热图；

（C）与凋亡表达相关的15个关键基因分析的热图。

【小结】

综上所述，作者开发了一种通过过渡激活自噬作用来克服PDT中的不足。利用呼吸抑制剂3BP来诱导过度自噬而将自噬作用从促生存转变为促死亡，从而提高治疗效果。通过LC3-/LC3-比率的增加和p62表达的下调，证明了3BP和PDT联合处理可显著增加自噬水平。而且，在通过降低HK-和GAPDH的表达来抑制糖酵解方面，3BP与真正的糖酵解抑制剂2DG相当。此外，通过控制3BP和Ce6的进料比，可以容易地调控3BP和Ce6的组成。此外，利用含3BP的纳米平台可减少O₂消耗来缓解肿瘤缺氧。在激光照射下，用CD-Ce6-3BP NPs治疗后，可以有效抑制细胞增殖和肿瘤生长。同时，3BP和PDT的结合可以通过消除原发肿瘤和下调HIF-1α表达来有效抑制肿瘤转移。总之，该研究不仅为缓解PDT中的肿瘤缺氧提供了一种简单的方法，而且对未来的癌症治疗创新方法提供了新思路。

文献链接：

3-Bromopyruvate-Conjugated Nanoplatform-Induced Pro-Death Autophagy for Enhanced Photodynamic Therapy against Hypoxic Tumor（ACS Nano, 2020, DOI: 10.1021/acsnano.0c01350）

本文由CQR编译。

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