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Cell Discovery：解决环状RNA研究最大难题，不影响线性mRNA的特异性敲低策略

GM 生物世界

RNA是我们遗传密码的一部分，存在于人体的每个细胞中。RNA的最广为人知的形式是一条单链，其功能众所周知，并已得到表征。但是，还有另一种类型的RNA，即所谓的环状RNA（circRNA），它们形成了一个连续的环状结构，因而更稳定且不易降解。

环状RNA（circRNA）最初是在30多年前发现的，但长期以来一直被认为是mRNA剪接过程的副产物，没有特定功能。近年来，人们在真菌、原生生物、植物、果蝇、小鼠以及人类细胞中发现了许多circRNA。越来越多的研究表明，circRNA并非mRNA剪接的副产物，而是在细胞中发挥重要作用的一类RNA分子。

大部分circRNA是由蛋白质编码基因（宿主基因）的外显子反向剪接产生的，因此，验证circRNA的功能并非易事，因为敲低circRNA的方法往往也会改变其宿主基因转录的线性mRNA的水平。

近日，美国布兰迪斯大学的研究人员在 Cell Discovery 杂志发表了题为：An in vivo strategy for knockdown of circular RNAs 的论文。

该研究描述了一种组织和细胞分辨率的体内特异性敲低circRNA的方法，利用靶向circRNA特异性反向剪接处的shRNA特异性敲低circRNA，且没有脱靶效应。

这一策略提供了在细胞和个体水平全面研究circRNA的方法，研究团队使用该策略首次产生了特定circRNA被下调的果蝇。

外显子来源的circRNA是一种高丰度的RNA类型，是通过特定外显子的环化过程产生的，这种过程称为反向剪接。circRNA以组织和发育阶段特异性的方式表达，而与宿主基因的表达无关。

实际上，高丰度的circRNA可以通过使转录向circRNA产生偏离来控制顺式表达其宿主基因，此外，circRNA还可以与RNA结合蛋白或miRNA结合，来调控基因表达，另外，一些circRNA也能编码蛋白，这些circRNA编码的蛋白通常与其宿主基因共享起始密码子，可能对突触和肌肉功能很重要。

许多研究表明，circRNA在多种生理活动和癌症等疾病中发挥重要作用，还有研究表明，circRNA可以介导细胞对病毒感染的反应。

circRNA领域的研究和投入越来越多，但circRNA领域仍面临一个主要障碍：在不改变同一宿主基因产生的线性mRNA水平的情况下，通常很难下调特定circRNA的表达量。

2017年9月，国际顶尖学术期刊 Science 杂志曾发表论文，通过Cas9基因编辑技术构建了第一个缺失特定circRNA的小鼠模型，但这一研究的前提是，被敲除的circRNA-CDR1as的宿主基因不表达线性mRNA。

在细胞层面，shRNA可以改变circRNA水平，但是shRNA介导的敲低通常效率低下（尤其是在哺乳动物系统中），并且可能导致线性mRNA转录产物出现不希望的敲低。

调控circRNA水平的另一种方法是删除负责外显子环化的内含子序列。这种方法在研究单个circRNA功能时可能是一个很好的选择，但是这种方法很费力，以至于无法用来全面筛选circRNA的功能，此外，这种方法无法区分circRNA的顺式和反式功能。

在这项研究中，研究团队利用了果蝇中miRNA和shRNA系统的功能分离优势，使用miRNA样前体作为shRNA载体，产生了特异性靶向反向剪接位点的shRNA。

这样就能在不改变宿主基因的mRNA水平的情况下实现对circRNA的特异性敲低，为了验证实际效果，研究团队用该方法靶向几种高度表达的circRNA，且验证了该方法的脱靶效应。检测结果表明，该方法显著敲低了circRNA的表达水平，且没有检测到脱靶效应，circRNA宿主基因的线性mRNA表达并未受到影响。

该研究描述了用于在体内特异性敲低circRNA表达的平台，并通过该方法生成了多个果蝇品系，其中特定circRNA被shRNA靶向敲低。此外，该研究观察到circCtrip对于果蝇的正常发育至关重要。总的来说，这项研究为在个体水平全面评估circRNA功能提供了新方法。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41421-020-0182-y

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