【催化】中科院苏州纳米所裴仁军研究团队在G-四链体/hemin脱氧核酶结构设计和催化活性提升的研究上取得进展

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G-四链体是由一段或几段富G序列通过分子内或分子间Hoogsteen氢键连接成具有四股核苷酸链的DNA二级结构，特定的阳离子（K⁺, Na⁺, NH₄⁺等）位于结构中心进一步稳定结构。相对于双链DNA来说, G-四链体结构具有离子依赖性而且根据富G序列的不同特点会呈现出不同的结构形态，因此为许多生物有机小分子提供了不同的识别位点。这些小分子配体不仅可以识别特定构型的G-四链体，而且形成复合物结构后能显示出非常特别的生物活性。其中引人注目的是，G-四链体与高铁血红素（hemin）形成的复合物显示出非常好的过氧化物酶催化活性，因此被称为G-四链体/hemin脱氧核酶（G4/hemin DNAzyme，又叫G-四链体过氧化物酶）。目前，G-四链体过氧化物酶作为一种人工酶或催化剂广泛应用在，诸如生物分析，分子机器和DNA传感器等多个领域。相较于传统的催化酶，它具有低成本，易操作和高的稳定性等优势，使得探究其催化的内在机理，进而提升催化活性的研究变得愈加重要。然而已有研究仅给出一些经验式结论（如，hemin更倾向于与平行或混杂型的G-四链体结合，hemin主要与平行G-四链体的3′末端的G-平面作用等）。

为探究G-四链体过氧化物酶催化的内在机理和一般规律以及建立高效的催化体系，中科院苏州纳米所裴仁军研究员课题组展开了系列工作。首先，项目团队研究了在d(G₃TG₃TG₃TG₃)序列（简写为TTT，它主要形成分子内平行G-四链体）的不同位置处引入极性转折位点，即设计了3′G5′-5′GGTG₃TG₃TG₃-3′（G55TTT）, 3′G₃TG₃5′-5′TG₃TG₃-3′（TG55TT）, 5′G₃TG₃TG₃TGG3′-3′G5′（TTTG33）和 5′G₃TG₃T3′-3′G₃TG₃-5′（TTG33T）四条序列，探究不同序列修饰对于结构形成和稳定性的影响。最终实验结果表明以上修饰不会改变结构的平行构型，然而不同极性转折位点的引入对G-四链体结构稳定性和结构末端堆积具有重要影响：如当序列中末端一个G碱基发生转置时，G-四链体结构的稳定性和分子间末端堆积相应增强，因此修饰后富G序列形成的G-四链体与卟啉分子（如NMM和hemin）的相互作用增强，因此有利于提升G-四链体过氧化物酶的催化活性；相反，如果在序列的中间位置（靠近中间T碱基处）引入转折位点，G-四链体结构的稳定性和分子间末端堆积相应减弱，因此不利于四链DNA结构与hemin的结合（图1）。该工作近期发表在Wiley旗下杂志Chemistry-A European Journal（Chem. Eur. J., 2020, 26, 8631-8638）。

图1. （A）G-四链体过氧化物酶在ABTS-H₂O₂体系下的催化流程图；（B-C）上述序列与NMM和hemin结合后荧光性能和催化活性对比

随后，项目团队选取较短的d(AGGGGA)序列为初始研究对象，该序列主要形成四分子平行G-四链体，同时末端的A碱基作为酸碱催化剂有利于进一步提升体系的催化活性。实验中，首先对d(AGGGGA)序列中的G碱基的8号位点进行选择性溴代修饰，这样可以改变鸟嘌呤核苷的顺反异构，有利于获得不同构型的末端G-平面。最终设计了d(AG^BrG^BrGGA) （F12）, d(AG^BrGGG^BrA) （F14）和 d(AG^BrGG^BrGA) （F13）三条序列，它们形成的四链结构见图2A-2D。图2E-2F显示，它们与卟啉分子NMM和hemin结合后荧光性能和催化活性大小顺序为：AG₄A ≈ F12 > F14 > F13。同时hemin亲和力测试实验与上述结果保持一致，由此可以得出平行G-四链体催化活性大于反平行G-四链体主要是由于结构中含有3′-末端G-平面，且末端G-平面中反式的鸟嘌呤核苷更有利于与hemin结合发挥催化性能。

图2. （A-D）AG₄A, F12 , F14和F13形成的四分子G-四链体；（E-F）四条序列与NMM和hemin结合后荧光性能和催化活性对比

在此基础上，项目团队对d(AGGGGA)序列进一步修饰——在序列的不同位置处引入极性转折位点，设计了3'AG5'-5'GGGA3'（AGS55）, 3'AGG5'-5'GGA3'（AG55）, 5'A3'-3'GG5'-5'GG3'-3'A5'（A33G55）, 3'A5'-5'GG3'-3'GG5'-5'A3'（A55G33）和 5'AGG3'-3'GGA5'（AG33）五条序列，它们形成的四链结构见图3。对比后发现，它们的催化活性大小顺序为：AG55 > AGS55 > A33G55> A55G33 > AG₄A >> AG33（图4）。结合hemin亲和力实验结果，可以得出增加3′-末端G-平面和3′ A碱基的个数均可以提升G-四链体过氧化物酶的催化活性。该研究成果近期发表在Royal Society of Chemistry旗下Chemical Science杂志上（Chem. Sci., 2020, 11, 6896-6906）。

图3.（A-E）AG55，AGS55，A33G55，A55G33和AG33形成的四分子G-四链体

图4.（A）AGS55，AG55，A33G55，A55G33和AG33在pH 5 KCl中的圆二谱图；（B）1.8 μM NMM分别滴定2.4 μM AGS55，AG55，A33G55，A55G33和AG33；（C）AG₄A, AGS55，AG55，A33G55，A55G33和AG33在KCl和NaCl（pH 5）的V₀值统计;（D）不同序列V₀值随溶液pH的变化曲线

随后，项目团队还设计出了具有酸性依赖性的G-四链体过氧化物酶。目前报道大部分的G-四链体过氧化物酶都显示在pH为弱碱性的溶液条件下显示较好的催化活性。而上述的实验结果显示，当G-四链体序列中含有多个末端A碱基时，在ABTS-H₂O₂体系下，弱酸性溶液中的催化活性较好。为了进一步设计出具有酸性依赖性的G-四链体过氧化物酶，项目团队在d(AG₄A)序列的3'末端引入-CCCCCCC（-C₇）片段，即d(AG₄AC₇)：该序列在特定的酸性溶液中可以组装为“G-四链体⁺I-motif”交替连接的超分子DNA结构，而在中性或碱性溶液中则主要以单链或不完全互补的双链形式存在。因此d(AG₄AC₇)当且仅当体系在弱酸条件下（pH 4.5-6.0）显示出较强的催化活性；同样原理，d(AG^BrGG^BrGAC₇)（F13C₇）, 3'AG5'-5'GGGACCCCCCC3'（AGS55C₇）两条序列与hemin形成的复合物结构显示出类似的特性；值得注意的是，3'AGG5'-5'GGACCCCCCC3'（AG55C₇）序列，由于3'AGG5'-5'GGA3'片段形成的四分子G-四链体具有非常强的热稳定性（T_m > 95 ℃），因此AG55C₇在酸性条件下组装超分子结构，而在非酸性条件下以四分子G-四链体单体形式存在，使得该序列的催化活性受pH影响有限（图5）。该工作近期发表在Royal Society of Chemistry旗下Chemical Communications杂志上（Chem. Commun., 2020, DOI: 10.1039/D0CC03082A）。