基于活性基因编码的荧光和发光探针:检测活细胞中的甲醛

科技工作者之家 2020-08-17

来源:材料科学前沿

背景甲醛(FA)是最简单的活性碳物质之一,众所周知,它是工业和生物医学应用中必不可少的化学原料,并且具有普遍的环境危害性和致癌性。鲜为人知的是,许多生命系统在生理过程产生FA,最后,被体内细胞分解。所以,在生理条件下FA可以维持稳态水平。虽然人们认为生理水平上的内源性FA是关键的一碳源和信号分子,但体内FA的含量增加已牵涉到许多疾病的病理学中。遗憾的是,FA在生理和病理学中的确切作用仍然知之甚少,而这激发了许多研究人员努力开发用于检测生物样品中FA的新工具。成果基于以上问题,来自北京大学深圳研究生院化学生物学与生物技术学院的彭涛副教授课题组,开发了一种新型的基于活性基因编码的荧光和发光探针,可用于检测水溶液和活哺乳动物细胞中的甲醛,无创、实时和可进行空间成像。而且,通过荧光和发光成像,该探针能够在活的哺乳动物细胞中以生理相关水平可视化FA。相关成果以“Activity-based Genetically Encoded Fluorescent and Luminescent Probes forDetecting Formaldehyde in Living Cells”为题,发表在《Angewandte Chemie-International Edition》上。图文解析1.探针的设计与检测原理wt_a12302200818003234_28876a.jpg图1 FA的基因编码荧光和发光探针的设计
研究者可以将量身定制的FA反应性UAA(非天然氨基酸)专门掺入EGFP(增强的绿色荧光蛋白)和fLuc(萤火虫荧光素酶)的必需赖氨酸残基中,并利用其调节其荧光和发光活性(图1A和1B)。赖氨酸85残基已被证明是EGFP生色团成熟和荧光所必需的,而fLuc酶促活性则需要赖氨酸529残基,因此设计并合成了赖氨酸PrAK(图1C):赖氨酸衍生的UAA可以与N-丙基取代基的2-氮杂-Cope反应,提高了烯丙基胺的亲核性。在EGFP和fLuc的赖氨酸残基处掺入的PrAK将关闭其荧光和发光活性。但与FA反应后,经历2-aza-Cope重排、水解和β-消除过程后,赖氨酸得以恢复(图1C),从而导致EGFP荧光和fLuc发光活性的恢复(图1A和1B)。2.细胞中FA的检测然后,研究者开始研究EGFP-K85PrAK是否可以在体外检测FA。为此,该蛋白在大肠杆菌中重组表达并纯化。如预期的那样,EGFP-K85PrAK蛋白仅在水性缓冲液中微弱荧光。相比之下,用增加量的FA处理EGFP-K85PrAK导致明显的荧光开启反应,呈剂量依赖性(图2A)。在低浓度下,EGFP-K85PrAK荧光与FA浓度之间存在线性关系。FA的体外检测极限估计为25μM。动力学分析表明,EGFP-K85PrAK对FA的荧光反应在1小时内几乎饱和。并且,其对FA具有良好的选择性(图4B),表明EGFP-K85PrAK可以很好的应用于细胞中FA的检测。wt_a22322000818003234_2c2e75.jpg图2 用纯化的EGFP-K85PrAK在体外进行FA的荧光检测。
3.活细胞中FA的可视化研究者通过共聚焦荧光显微镜检查了EGFP-K85PrAK在活细胞中可视化FA的潜力。为此,转染HEK293T细胞以表达具有C末端mCherry标签的EGFPK85PrAK或EGFP-K85PrAK-mCherry。FA处理后,在表达EGFP-K85BocK或EGFPK85BocK-mCherry的细胞中未观察到荧光信号,用NaHSO3(FA清除剂)预处理细胞会大大减弱细胞内荧光反应(图4A)。对于EGFP-K85PrAK-mCherry,观察到FA诱导的EGFP荧光和mCherry信号共定位,进一步验证了成像结果(图4A)。为了证明EGFP K85PrAK可以可视化来自细胞内的FA,用四氢叶酸或在叶酸中代谢的5,10-亚甲基-四氢叶酸处理了表达EGFPK85PrAK或EGFP-K85PrAK-mCherry的细胞,并在这些细胞中观察到确实的、强的和剂量依赖性的荧光反应(图4B)。相比之下,叶酸循环中的其他成分没有诱导任何荧光增加,显示了不同的代谢活性。这些结果证明EGFP-K85PrAK能够成像活细胞中生理相关和内源性FA。wt_a32302020818003235_31f611.jpg图3 EGFP-K85PrAK-mCherry对活HEK293T细胞中FA的共聚焦荧光成像4.开发基因编码的发光FA探针wt_a32302020818003235_360b2c.jpg图4 用fLuc-K529PrAK在溶液和活细胞中进行FA的发光检测最后,研究者扩展了开发遗传编码的发光FA探针。实际上,fLuc-K529PrAK在含ATP和荧光素的水溶液中显示出对FA的强且剂量依赖性的发光开启响应(图5A,5B),而对于fLuc-K529BocK则未观察到发光变化(图5A和5B)。值得注意的是,fLuc-K529PrAK能够在生理浓度下检测FA(图5A和5B),检测极限估计为25μM。更重要的是,在表达fLuc-K529PrAK的活HEK293T细胞中,FA处理以0.1至2 mM的FA剂量依赖性方式导致了更强的发光增强,而在表达fLuc-K529PrAK的细胞中则没有-K529BocK(图5C和5D)。总之,这些数据表明,fLuc-K529PrAK是一种遗传编码的发光探针,可在体外和活细胞中以生理水平检测FA。总结总而言之,研究者开发了两种新颖的基于活性基因编码荧光和发光探针EGFP-K85PrAK和fLuc-K529PrAK,分别用于检测活细胞和水溶液中的FA。这些探针将FA的2-aza-Cope反应性与位点特异性蛋白质工程和调控相结合,以提供针对潜在干扰物种对FA的生物学相关浓度的选择性荧光和发光开启响应。重要的是,EGFP-K85PrAK和fLuc-K529PrAK能够在活细胞中以生理水平成像细胞内FA。由于具有遗传编码能力,这些探针具有许多独特的功能,可作为FA成像的强大工具
文章链接:https://doi.org/10.1002/anie.202001425

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