Nature争鸣 | 阿尔兹海默症“里程碑式的发现”是实验污染所致吗？

撰文 | Qi

责编 | 兮

阿尔兹海默症（Alzheimer's Disease, AD）是最常见的一种以患者的记忆力减退，认知能力障碍，情绪调节异常等为特征的神经退行性疾病。伴随人口寿命的增长，这类严重威胁中老年生命质量的疾病发病率也与日俱增，然而截至目前，对其发病机制的各种解释呈百家争鸣的局势。其中最为普遍被人们接受的是淀粉样蛋白假说（The amyloid hypothesis），淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）作为这一假说的核心，其被β-与γ-分泌酶切割生成的β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）长期以来被认为是导致AD相关病理损伤的始作俑者。因此，从根本上解决Aβ的产生机制问题对于开发针对于AD有效的治疗手段显得尤为重要。

2018年11月29日，美国桑福德·伯纳姆·普雷比医学发现研究所（Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute）的Jerold chun与Tao Long研究组（下文统一简写为Lee等）在Nature上合作发表题为“Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal neurons”的文章【1】。该研究成果曾被置于Science官网头版头条报道，并被评价为点燃阿尔兹海默症的“里程碑式的发现”。

文章中，Lee等通过对散发性阿尔兹海默症（sporadic Alzheimer's Disease, SAD）患者和健康个体的大脑分选出的神经元细胞核进行研究，提出大脑神经元中的APP基因存在不同于野生型基因座的形式，而是以不计其数的变异“基因组cDNA”（genomic cDNA, gencDNA）的形式通过“镶嵌”模式插入到基因组当中。随后，作者们在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中模拟APP gencDNA生成，通过H2O2刺激和核苷逆转录酶抑制剂（RTi）处理，提出gencDNA形成的必要条件：即DNA断裂和逆转录酶活性。接下来，在AD的J20小鼠模型中借助用于鉴定人APP gencDNA的DNA原位杂交（DNA in situ hybridization, DISH）探针也在2.3年观察期间内检测到与年龄相关的gencDNA增长。

该研究认为，基于gencDNA内含子缺失，外显子间经由外显子内接头（intra-exon junctions, IEJs）连接，碱基插入、缺失或单核苷酸变异（single-nucleotide variants, SNVs）等序列特征，以及对转、DNA断裂、逆转录酶活性的要求，gencDNA可能产生于神经元内RNA发生的“逆转录-插入”事件（retroinsertion）诱发的体细胞基因重组（somatic gene recombination, SGR）。值得注意的是，截至当时尚未有任何关于特定基因可能发生体细胞基因重组研究的报道。

图一，工作模式图

那么，APP gencDNA是否能被转录及翻译成为具有生物活性的产物呢？研究人员在体外构建分别包含三种APP gencDNA变体的质粒，在SH-SY5Y细胞系中过表达并检测其细胞毒性，结果显示三种APP gencDNA变体中的两个能明显降低SH-SY5Y细胞的存活率。由此我们可以得知，并非所有类型的gencDNAs都能产生致病性影响，正如研究中所提到的在健康个体大脑的神经元中也能检测到多种gencDNA的存在，不过种类和丰度相较于SAD个体而言均有3-5倍的降低。

总体而言，这项研究提供了特定基因（本文中为APP）可以发生体细胞基因重组的新思路。健康及患病个体大脑中APP gencDNAs的存在可能与神经元正常生理功能及阿尔兹海默症的发病机制都具有相关性，这一发现能否解释以往针对Aβ的临床治疗方案失败的原因，还需要进一步的研究来验证。

出乎意料的是，2020年8月19日，来自波士顿儿童医院的Christopher A. Walsh与 Eunjung Alice Lee研究组（下文统一简写为Kim等）对该文章的结论提出质疑，并在Nature上发表题为“APP gene copy number changes reflect exogenous contamination”的文章【2】，指出Lee等检测出的APP gencDNA是外源污染的假象，并非真正的来自于内源APP的体细胞基因组整合。

首先，Kim等研究人员对Lee等的原始APP靶向测序数据进行分析，虽检测到了APP基因的IEJs，却未能检测到跨APP和目标插入位点的任何读段；取而代之的是，在APP编码序列的两端检测到多个含pGEM-T Easy Vector多克隆位点的剪接片段，并且在Lee等所在实验室的一项关于小鼠脑内体细胞拷贝数变异的研究中，在小鼠单神经元全基因组测序（single-cell whole-genome sequencing , scWGS）数据集中观察到同一人源APP pGEM-T Easy Vector以及另一携带APP插入序列的质粒骨架序列（pTripIEx2）污染的情况，指出该实验室存在多种类型的重组载体反复污染的情况。

随后，从Lee研究中的SureSelect杂交捕获测序数据中，通过计算包含载体骨架序列的剪接片段占APP编码序列两端的总读取深度的分数以表示载体污染的水平，而每个APP外显子连接处检测的剪接片段的分数，表示APP gencDNA的总量（APP逆转录拷贝或载体插入片段）。编码序列末端包含载体骨架的分数为1.2％，与外显子连接处1.3％的分数相当，因而Kim等认为载体污染是所有外显子连接处剪接片段的主要来源。此外，Kim等认为即使囊括这些源自载体的读段在内，所有分数都远低于Lee研究中DISH实验结果给出的16.5％gencDNA的保守估计。

接下来，他们在Lee等最新的以6名AD患者和1名对照个体大脑生成的全外显子测序（whole-exome sequencing, WES）数据中发现APP巢式PCR（nested PCR）产物，即WES中支持APP gencDNA的读段与原始Lee研究中使用的巢式PCR引物的目标位点对齐。不仅如此，他们在Park等人【3】的一项展示AD患者脑样本的深度WES数据集的独立研究中，发现全基因组人类和小鼠mRNA污染的证据，且主要存在于WES数据集中报告支持APP gencDNA的读段。Kim等研究人员认为，即使在采用高质量控制标准的情况下，二代测序实验中仍普遍存在外源性污染，并强调需要进行严格的数据分析以减轻这些重要伪像的来源。

进一步的，Kim等为了验证Lee研究中的IEJs可能是污染的PCR扩增产生的PCR伪像（artefact）的猜想，他们使用携带两种不同APP亚型（APP-751，APP-695）的重组载体，以及报道的PCR引物与三种不同的PCR酶重复了RT-PCR和PCR分析。结果显示，在APP插入片段和PCR酶的所有组合下，均明显观察到与原始APP插入片段相比大小各异的嵌合扩增条带，进一步的通过测序确认它们的确包含APP插入片段的许多IEJs。而Lee研究中先前鉴定的17个IEJs中有12个同样出现在这次测序结果中，因此认为先前鉴定的APP gencDNA均可能是来自外源污染的PCR伪像。

最后，为了独立研究是否真实存在潜在的APP gencDNA，Kim等研究人员在来自64个AD和119个对照个体神经元scWGS数据中检索体细胞APP gencDNA。如果存在逆转录基因插入，则应该能观察到明显的序列特征：外显子读取深度的增加，外显子连接处的读段剪接，3'UTR末端的poly-A尾巴，和跨外显子的不一致读对，然而却没有发现任何APP gencDNA存在的证据。

根据这些结果，Kim等研究人员认为Lee等报道的APP gencDNA似乎可以归因于各种类型的外源性污染，尤其是APP重组载体，PCR产物和全基因组mRNA污染。他们希望Lee等有必要提供明确的证据，例如支持新的APP插入微点的读段，排除污染因素等，以证明在神经元中APP基因确实能够发生体细胞基因重组现象。

在同期Nature上，针对他们提出的质疑，Lee等作出如下回应【4】。

1）体细胞基因重组的可预测结果是产生不同于野生型基因座的新型逆转录转座插入位点，先前研究中已经DISH证实；且由激光捕获的人海马或血液中DNA的全外显子组下拉产生的独立发表的数据集的分析显示，在八条不同的染色体中鉴定出十个不同的APP插入位点。Lee等表示目前还未能察觉可能产生这些结果的污染源，这些结果与DISH数据所显示的APP gencDNA的位置与野生型APP不同完全一致，且这些新的APP gencDNA插入位点强烈支持APP gencDNA的自然发生。

图二，鉴定人类基因组中新的APP插入位点

图三，双探针DISH显示gencDNA与野生型基因座定位

2）Lee等认为Kim等在个别数据集中发现的外源载体污染（pGEM-T Easy APP）并不能确切的解释所有的APP IEJs。对另外三个包含APP gencDNA读段的数据集进行信息分析，已经VecScreen和Vecuum script【5】排除可能的质粒污染。

3）针对Kim等提出在Park等的AD患者脑样本的深度WES数据集中存在全基因组人类和小鼠mRNA污染的问题，Lee等表示mRNA逆转录为cDNA这一过程需要逆转录酶活性，然而在Park等人使用的Agilent SureSelect靶向序列捕获技术中并未涉及逆转录酶，因而不能以全基因组mRNA污染来否认APP gencDNA的存在。

4）针对Kim使用含不同亚型APP的质粒进行PCR产生包含IEJs的序列，这种非生物性的方法与Lee等鉴定生物性质的IEJs的方式之间主要存在以下几点差异：a，除了使用相同引物序列外，实验条件有所不同：Kim等人使用两倍浓度的引物和超过一百万倍浓度的模板；b，Lee等利用单分子实时测序（single molecule real-time sequencing, SMRT-seq）鉴定gencDNAs和IEJs序列时仅使用30个PCR循环即可检测到，而Kim等则运行40个PCR循环；c，Lee等仅鉴定出了来自AD个体的大脑的45个独特IEJs和来自健康个体大脑的20个（有重叠部分，少于65个），而Kim等鉴定出12426个（约200倍）。

5）值得注意的是，Kim等提出的“外源污染”观点无法解释疾病状态下APP gencDNA形式和丰度的显着变化，且这种变化在比较细胞类型时也很明显，即当同一SAD个体的大脑样本中不同细胞类型由DISH同时处理时，信号在神经元中比在非神经元细胞中更为普遍。至关重要的是，SMRT-seq仅在SAD个体样本中鉴定出在家族性AD中被认为是致病性的单核苷酸变异，然而携带这种变异的质粒并不存在于该实验可能涉及的任何一个环节。

6） Lee等认为Kim将SureSelect杂交捕获测序数据与DISH的APP gencDNA拷贝数估计放在一起比较完全没有意义，因为两种方法根本不同。首先是杂交介质的不同（前者为液相，后者为固相），其次为靶向序列的差异（前者靶向野生型基因座和gencDNA，后者仅靶向gencDNA）。

7）Kim等通过检索自己的scWGS数据得出的APP gencDNA的阴性结果，这并不能反驳APP gencDNA的存在。Kim等自认“基因组扩增不均”，导致约20％的单细胞基因组覆盖深度不足10x，并且在一个等位基因（~9％等位基因缺失率）或两个等位基因（~2.3％基因座缺失率）处均可能出现扩增失败。该失误率很可能会错过这些小至约0.15 kb的APP gencDNA。

综上讨论，Lee等认为支持体细胞基因重组和APP gencDNA的数据以及结论仍是完整的，因此有必要在健康及AD大脑中对APP gencDNA的产生机制和病生功能继续进行研究。有趣的是，gencDNA对逆转录酶活性的依赖性，可能与65岁以上且接受长期联合抗逆转录病毒疗法（cART，其中包括逆转录酶抑制剂）的HIV感染者中极其少见罹患AD的情况相关【6,7】。如果得到证实。gencDNA及其产物可能能够解释AD发病机制，并有助于推动新治疗策略的发展。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-018-0718-6

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2522-3

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2523-2

制版人：MENG

1, Lee, M. H. et al. Somatic APP gene recombination in Alzheimer’s disease and normal neurons. Nature 563, 639–645 (2018).

2, APP gene copy number changes reflect exogenous contamination

3, Park, J. S. et al. Brain somatic mutations observed in Alzheimer’s disease associated with aging and dysregulation of tau phosphorylation. Nat. Commun. 10, 3090 (2019). 4, Reply to: APP gene copy number changes reflect exogenous contamination

5, Kim, J. et al. Vecuum: identification and filtration of false somatic variants caused by recombinant vector contamination. Bioinformatics 32, 3072–3080 (2016).

6, Turner, R. S. et al. An individual with human immunodefciency virus, dementia, and central nervous system amyloid deposition. Alzheimers Dement. (Amst.) 4,1–5 (2016).

7, Centers for Disease Control and Prevention. HIV Surveillance Report, 2016 Vol. 28 http://www.cdc.gov/hiv/library/reports/hiv-surveillance.html (2017)