基于细胞外RNA的疾病诊断技术 | “自然展望-细胞外RNA”增刊

点击上方蓝字，关注我们！

来源：David Parkins

人体组织间的通讯主要是通过细胞间相互传递RNA信号实现的。这让科学家相信，通过“监听”血液、唾液、尿液或其他体液携带的这些细胞外讯息，就能“截取”关于健康和疾病的情报。

如果真有那么简单就好了。加州大学圣迭戈分校的围产学家Louise Laurent说：“我们刚进入这个领域的时候都有一点天真。”

如今，越来越多像Laurent一样的科学家正在努力开发微创RNA检测技术，用于癌症、心脏病、神经退行性疾病和其他疾病的早期发现和临床管理。但是细胞外RNA（exRNA）分子本身的多样性以及它们的运输载体，都给科学家带来了不小的挑战。Laurent说：“我认为当初没有人料到生物学竟是如此的复杂。”Laurent的研究方向是利用exRNA预测妊娠并发症。

RNA分子库具有很大的异质性，这使得从背景分子噪音中识别出具有临床意义的生物标志物变得非常困难。此外，从生物样本中收集、处理和分析exRNA也存在着各式各样的技术难题。这些问题令比较来自不同实验室的结果一事变得困难，而这些比较恰恰是发现和验证exRNA生物标志物的一个必要步骤。

细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是一种脂质分子的包膜结构，大小几乎只有单个人体细胞的千分之一，但可以保护囊泡内容物不受大部分生物体液中的RNA降解酶的作用。以分离EV为例，一项研究曾分析了约1700个涉及囊泡的实验，发现了1000多种从生物体液中提取囊泡的不同方法[1]。不同方法之间看似只有细微差别，比如使用不同转子对样品进行分离，但是，正如该研究的作者、比利时根特大学研究EV的癌症生物学家An Hendrix所指出的那样，“更改部分参数确实会影响从样本中分离出的囊泡。”

过去五年里，将exRNA用于诊断的相关研究不断涌现，院校和企业纷纷涉足这一领域，希望能够找到具有临床意义的技术。随着生物和技术领域的不断发展，科学家终于开始抽丝剥茧，逐渐了解RNA分子是如何被紧紧包裹在EV和其他载体内部，以及这些分子信号在不同生理或病理条件下有哪些作用。

细胞外RNA通讯联盟（ERCC）等项目也鼓励研究人员开发新方法，进一步提高exRNA检测的标准化和可重复性。ERCC是美国国立卫生研究院（NIH）于2013年发起的一项为期10年、耗资1.6亿美元的项目，旨在推动基于exRNA诊治方法的临床开发工作。

尽管大规模临床推广仍存在困难，尤其是如何获得纯化囊泡的问题，但部分基于生物体液中exRNA印迹的“液体活检”检测试剂已投入市场，为癌症诊断不明确的患者提供有用信息。之后还有望推出针对所有疾病类型的类似诊断探针。

“整个领域取得了巨大进步。”NIH下属、位于马里兰州贝塞斯达的国家转化科学推进中心特殊研究项目副主任、分子遗传学家Danilo Tagle说。他目前正在帮助ERCC项目进行协调工作。“不少企业有意将现有的一些方法做成产品。”他说。

在马萨诸塞州沃尔瑟姆市的一间实验室里，技术员每月要例行处理数千瓶尿液标本。他们从每个样本中提取出所有的EV，然后分离出EV里的大量RNA。

这里是Bio-Techne的子公司Exosome Diagnostics的所在地，它是世界上第一家推出基于EV的临床诊断试剂的公司。这款名为ExoDx的检测试剂主要针对血液中前列腺特异性抗原（PSA）轻度升高的年长男性，帮助他们决定是否需要进行前列腺穿刺活检。

所谓前列腺穿刺活检，是用一个细针头经直肠穿入前列腺取出一小块组织。活检操作可能会出现疼痛、出血、感染、膀胱问题等。但如果不进行活检，又很难对那些PSA处于“灰色地带”（2-10ng/ml）的患者加以区分，明确哪些患者可能有需要切除的侵袭性高级别（high-grade）肿瘤，哪些患者不干预也无大碍。根据目前的估算，有不到四分之一的PSA水平居中的男性，最后被发现罹患了侵袭性肿瘤。

ExoDx通过定量检测男性尿样EV中三个特定RNA分子的水平，以期帮助更多男性患者避免侵入性活检，以及随之而来的过度治疗。在这三个RNA分子中，两个与编码调节蛋白的基因有关——一个能促进癌症，另一个能抑制肿瘤，而第三个RNA分子与携带制造非编码蛋白质RNA指令的基因有关，这些非编码RNA参与了前列腺癌的发生。通过评估这些基因的相对活性，检测试剂就能推算个体罹患前列腺恶性肿瘤的风险。

两项临床试验入组了超过1000名PSA水平中等的男性，验证了ExoDx具有较好的预测能力，判断哪些人存在癌症隐患，需要考虑进行活检；哪些人的疾病倾向于良性，可以合理选择观察随访[2][3]。

Exosome Diagnostics也在开拓其他的临床领域。正在开发的第二款基于EV的尿液检测试剂可以尽早预测哪些肾移植患者可能发生排异。基于血液中exRNA和循环肿瘤DNA水平检测肺癌患者基因突变的血液检验也在开发中。“这不仅是一种诊断方法，更是一个平台。”Exosome联合创始人兼首席科学官Johan Skog说。

Johan Skog在Exosome位于马萨诸塞州沃尔瑟姆的实验室中处理样本。来源：Johan Skog / Exosome Diagnostics

许多其他分子诊断公司和学术研究团队也在设法利用exRNA发现癌症预警信号或进行危险分层。例如，加州森尼韦尔市Cepheid公司和新西兰达尼丁市Pacific Edge公司的尿液检测试剂通过测定五种编码蛋白质的RNA水平，可以在最早阶段发现膀胱癌的信号或是监测治疗后肿瘤复发的征兆。这种检测思路与Exosome公司的尿液检测相似，都是通过采集恶性肿瘤源周围的体液，检测其中由肿瘤分子释放的RNA。相同的方法还被用来检测脑脊液中与脑肿瘤有关的RNA，以及唾液中与口腔癌相关的RNA等。当然，肿瘤释放的RNA也可以遍布全身。

大多数团队的主要研究方向都是在血液中寻找系统性的exRNA印迹。但是，加州大学洛杉矶分校的口腔生物学家David Wong证明在唾液中也可以检测到exRNA。Wong与首尔三星医疗中心的临床医生合作，对约2500人的唾液进行了检测，鉴定出一个由9种RNA（部分来自人类，部分来自细菌）组成的唾液印迹，可以较准确地预测哪些人会罹患胃癌——韩国最常见的恶性肿瘤之一。

不管采用哪种体液，exRNA可能只构成诊断方程式的一部分。因此，Freenome公司一直在尝试在结直肠癌筛查中采用多组学方法，全面了解肿瘤的生物学特性。他们检测的内容包括血液样本中的RNA、蛋白质、DNA、表观遗传学生物标志物，以及其他能够提示疾病信息的循环标志物。

“我们需要不同的诊断方法，”加州南旧金山市的Freenome公司的首席科学官Jimmy Lin说，“单靠一种分析物无法检测到全部信息”以揭开潜伏在分子阴影中的癌症的面纱。

Freenome的科学家在今年的一次会议上报告（请参阅go.nature.com/3ge6wjc）说，该公司的平台依靠机器学习算法筛选大量生物学数据，识别出了90％以上的癌症病例，其表现优于一种已获批的基于粪便的测试。而该粪便测试是目前唯一一个可在结肠癌筛查中替代结肠镜的检查方法。由于结肠镜检查的不舒服与不方便，很多人都会跳过这种常规检查。

少数专注于exRNA的新兴公司正在关注癌症诊断以外的领域，比如心脏和大脑疾病。位于马萨诸塞州列克星敦的Dyrnamix公司正在开发exRNA诊断技术，为心血管疾病患者提供个体化治疗。与此同时，位于几公里之外纳蒂克的Neurodex公司则着眼于从血液中捕捉神经元衍生的外泌体，通过仔细研究其中的RNA和蛋白质，希望能发现阿尔茨海默氏症的早期征兆。

“整体而言，”Neurodex的首席科学官、训练有素的神经科学家Erez Eitan说，“神经学领域的研究人员对RNA兴趣不大。”他解释说，与癌症不同，神经系统疾病的病理学机制存在于蛋白质水平，而非DNA或RNA，因此研究人员对RNA在神经变性中的作用了解不多。

这从一定程度上解释了，为何大多数用于阿尔茨海默氏症症状前检测的实验性血检，都是通过测量血液中的β-淀粉样蛋白片段、活化的tau或其他一些蛋白质的水平来进行的。这些蛋白质在大脑中的积聚已经成为阿尔茨海默氏症的特征。不过，加州圣迭戈退伍军人事务应激与心理健康卓越中心（Veterans Affairs Center of Excellence for Stress and Mental Health）的神经科学家Victoria Risbrough说，这种策略就好比通过翻找某人的垃圾桶来推断他如何生活。Risbrough认为，摸清它们的脾性的更好办法，是掌握它们的通讯内容——而这正是exRNA能够体现的。

“RNA让我们得以一窥某些病理表现背后的可能的原因。”Risbrough说。她目前正在和UCSD的神经病理学家Robert Rissman合作开发颅脑损伤的诊断方法。“我们不再翻找垃圾桶了，而是开始查看它们的短信。”

全面筛查大脑疾病依旧是研究人员的终极目标。但位于新泽西州Monmouth Junction地区的DiamiR公司的联合创始人兼首席执行官Kira Sheinerman认为，大部分成功研发的exRNA诊断试剂所迎来的首批客户可能是开展研究性治疗临床实验的制药公司。

以DiamiR开发的、针对大脑中含量丰富且与炎症相关的各种microRNA的血液检测试剂为例，Sheinerman和同事们证明了这类试剂可以预测目前尚无认知障碍迹象的老年人是否会继续发展为阿尔茨海默氏症，其准确率可达84%。Sheinerman认为这类信息可以帮助药物开发人员和临床研究人员更好地识别还未出现症状的阿尔茨海默氏症患者，这个群体可能也是正在进行临床评估的实验疗法的理想候选对象。

即便最终这些exRNA检测未能获得广泛应用，“它们对于疾病新假说的提出仍然有其价值。”俄勒冈健康与科学大学的神经病学家 Joseph Quinn指出。通过与分子神经生物学家Julie Saugstad合作，Quinn发现了一连串具有阿尔茨海默氏症诊断潜力的microRNA，同时也为将来的药物开发提供了可能的生物学途径。但是，Quinn警告称，这一过程背后的科学机制尚未完全摸清。因此，他在exRNA诊断领域的研究——和其他许多研究人员的一样——仍处于探索阶段。

探索的一个方面是要开发出能改良EV分离方法的工具。尽管一些研究人员成功在未从体液中分离EV的情况下完成了exRNA分析，但这种“抓大放小”的RNA分析法常常会遗漏一些不明显的生物相关性信号。因此，该领域正在慢慢由人类生物体液总RNA测序的方法，转向锁定目标器官分泌的特定囊泡。“现在要锚定的是信号发出的位置。”波士顿的麻省总院心脏电生理学家、Dyrnamix联合创始人Saumya Das说。

依照传统方法，科学家将样本加入超速离心机中提取EV，然后利用分子成分的大小和密度差异获得目标囊泡。但是这种方法并不完美。“污染仍然存在，”荷兰乌得勒支大学免疫细胞生物学家Esther Nolte-’t Hoen说， “仅依靠大小和密度差异，纯度无法达到100％。”

正在开发中的技术包括利用不同直径的细孔过滤EV，或使用结合剂将目标EV从样品中分离出来。无论采用哪种方法，都需要经验证的标准物质才能进行准确校准——而这种物质直到最近才出现。

去年，根特大学的Hendrix和她的同事开发出了一种生物工程改造的EV，可以加入生物体液，再进行实验追踪帮助检查样品制备和分析方法的准确性[4]。“整个领域一直在寻找这种参考物质。”Hendrix说，她与全球数十个实验室共享了她的可追踪EV。她说：“每次我在会议上作完技术汇报，都会收到多个技术共享的请求。”

Hendrix和包括Nolte-’t Hoen在内的其他人都在积极参与社区建设和数据报告项目，以确保针对含有RNA的EV的相关研究可以得到正确解读和重复，包括那些聚焦疾病诊断的研究。“这项工作可能不是科学研究中最令人激动的，”Nolte-’t Hoen说，“但却是必须要做的。”

为此，NIH正通过其斥资数百万美元的庞大项目，致力于找到分离单个EV以及分析其内容物的更好方法。目前开发中的基于exRNA的诊断测试很少能达到这个精度——许多甚至都不对EV进行富集——这对于很多临床应用来说可能问题不大。

但是，Tagle表示，“从严谨性的角度出发，我们必须知道信息（数据）的具体来源，才能最终获得更加可靠、可重复的研究结果。”

Elie Dolgin是马萨诸塞州萨默维尔的一位科学记者。

参考文献：

1. Van Deun, J. et al. Nature Meth. 14, 228–232 (2017).

2. McKiernan J. et al. JAMA Oncol. 2, 882–889 (2016).

3. McKiernan J. et al. Eur. Urol. 74, 731–738 (2018).

4. Geeurickx, E. et al. Nature Commun. 10, 3288 (2019).

喜欢今天的内容吗？喜欢就给我们一个“三连”（转发，将公众号设为星标🌟，在看⇣⇣）吧！