【研究】荧光定量聚合酶链反应与染色体核型分析结果在产前诊断中的一致性

中华医学会围产分会

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本文引用格式：

杨昕，李发涛，易翠兴，等.荧光定量聚合酶链反应与染色体核型分析结果在产前诊断中的一致性[J].

中华围产医学杂志, 2020, 23(6):400-404.

DOI：10.3760/cma.j.cn113903-20200309-00216

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杨昕　李发涛　易翠兴　袁思敏　柯茗　李东至　廖灿

广州市妇女儿童医疗中心产前诊断门诊　510623

通信作者：廖灿

Email：canliao@hotmail.com

电话：020-38076008

染色体核型分析技术是目前产前诊断胎儿染色体病的“金标准”，但其最大的缺点是实验操作复杂，检测时间长，质控困难。1998年，荧光定量聚合酶链反应技术（quantitative fluorescent-polymerase chain reaction, QF-PCR）应用于产科临床。QF-PCR具有快速、简单、廉价和容易质控等特点，得到临床医生及实验室技术人员的认可。一项包含22 504例产前诊断病例的回顾性研究表明[1]，QF-PCR对常见染色体病（13-、18-和21-三体及性染色体病）的检出率高达98.6%（95%CI：97.8%~99.3%），但QF-PCR的局限性在于无法检测染色体结构异常和＜30%的染色体嵌合体[2]。一些回顾性研究推荐，在产前诊断病例中，对于唐氏综合征高风险而胎儿超声结构未见异常的病例，可将QF-PCR作为一线检测方法；当发现胎儿颈项透明层（nuchal translucency, NT）增厚，则对超声结构异常或者有既往染色体病生育史的病例加做染色体核型分析[3-4]。这种策略不仅可以减少产前诊断费用，加快检测速度，还可以尽量避免不明确的染色体核型结果。但是这一策略目前仍存在较大争议 [5-6]。在国内，临床上仍将染色体核型分析结果作为胎儿染色体病的最终诊断标准。随着QF-PCR的临床应用越来越普遍，目前临床上亟待解决的问题是，当QF-PCR提示胎儿染色体异常时，临床医生应建议孕妇及家属继续等待核型结果（4~5周），还是建议直接选择终止妊娠。本研究拟探讨本院介入性产前诊断病例中染色体核型分析和QF-PCR分析结果的一致性，为临床医生提供准确可靠的临床数据。

一、资料与方法

1.研究对象：研究对象为2010年1月至2017年12月广州市妇女儿童医疗中心产前诊断门诊同时进行染色体核型分析及QF-PCR检测的产前诊断病例。所有孕妇在接受介入性产前诊断前均签署知情同意书，并签署染色体核型分析及QF-PCR检测技术知情同意书。

介入性产前诊断的临床指征主要包括唐氏筛查高风险（＞1/270），高龄（≥35周岁），胎儿超声结构异常，以及曾育唐氏综合征患儿等。介入性产前诊断方法包括绒毛穿刺（11~13周+6），羊膜腔穿刺（16~24周+6）及脐带血穿刺（≥22周）。

2.染色体核型分析技术：按照常规羊水细胞培养，常规制片G显带，每个患者计数30个染色体中期分裂相。按人类细胞遗传学命名的国际体制1995年分析标准确定染色体异常核型。具体细胞遗传学检查方法参见文献[7-10]。

3. QF-PCR技术：（1）产前诊断标本采用微量基因组柱提试剂盒（德国QIAGEN公司）提取DNA，DNA浓度10~50 ng/µl，纯度1.7~2.0。（2）引物设计：针对XY、21、13及18号染色体设计23个短串联重复序列（short tandem repeat, STR）位点，其中性染色体为AMXY、SRY、DXS1187、DXS8377、DXS6809、DXS981和DXS1053；21号染色体STR位点为D21S1433、D21S1411、D21S1412、D21S1414、D21S1445和D21S11；18号染色体STR位点为D18S535、D18S51、D18S380、D18S386和D18S391；13号染色体STR位点为D13S634、D13S258、D13S628、D13S303和D13S305。每个扩增引物正向链的5'端分别标记荧光素。（3）DNA标本在PE9700PCR扩增仪（美国ABI公司）上进行扩增。14对引物在3个PCR管中反应。PCR反应体系：总体积25 µl，其中DNA 50~100 ng，dNTP终浓度 200 µmol/L，1×Buffer（缓冲液），氯化镁终浓度2.0 mmol/L，引物终浓度0.2 µmol/L，Taq聚合酶1 U。PCR反应条件为预变性（95℃ 2 min）、变性（95℃ 20 s）、退火（58℃ 30 s）、延伸（72℃ 45 s），共25个循环。（4）取1 µl PCR反应产物与9 µl上样液（包括8 µl甲酰胺及1 µl分子内标ROX）混合，95℃变性 3 min，立刻放入冰浴中5 min；在美国ABI3100遗传分析仪上电泳，POP4凝胶，内在分子量标准35~500 bp（单链）。（5）GENESCAN基因分型软件（美国ABI公司）对凝胶上扩增产物及内标的位置，进行扫描分析，确定产物片段的大小。（6）阳性结果判定：在所有STR位点中，通过分析任意一个STR位点等位基因扩增片断的个数及等位基因峰面积比，判断染色体数目的畸形。出现3个等位基因峰，或出现2个等位基因峰且等位基因峰面积＞1.6为阳性。对于X染色体，本研究将D21S1433作为内参照，AMXY的等位基因峰面积与D21S1433任一等位基因峰比例＜1.3作为45,X的诊断标准[11]。

4.随访：本单位所有接受介入性产前诊断的病例均进行出生后随访。随访时间为预产期3个月后，随访方式主要为电话随访。随访内容主要包括分娩方式、新生儿出生体重及发育状况和智力水平等。所有随访结果均记录在本单位的产前诊断工作站中。本研究中，对产前诊断结果提示为染色体嵌合体的病例进行再次随访，并记录在产前诊断工作站中。

5.数据分析：从本单位自行建立的产前诊断工作站获取纳入研究孕妇基本信息、产前诊断指征，以及染色体核型分析和QF-PCR结果。分别统计2种检测方法的检测成功率，染色体核型正常及异常的检测一致率，并分别统计2种方法对常见染色体病的检测一致率。

6.统计学分析：采用SPSS 16.0软件对数据进行分析。计量资料以M（min~max）表示，计数资料采用例数和百分数表示。采用受试者工作特性（receiver operative characteristic, ROC）曲线分析QF-PCR检测染色体病嵌合体的灵敏度和特异度，并计算Youden指数，即（灵敏度＋特异度－1）。将Youden指数的最大值作为最佳临界值。

二、结果

（一）一般情况

研究期间，本院产前诊断门诊共完成介入性产前诊断21 689例，其中同时进行染色体核型分析及QF-PCR检测的病例10 967例（50.56%）。10 967例中，绒毛穿刺965例（8.80%），羊膜腔穿刺9 721例（88.64%），脐带血穿刺281例（2.56%）。

（二）染色体核型分析及QF-PCR检测失败结果分析

10 967例产前诊断标本中，109例（0.99%）染色体核型分析培养失败。QF-PCR分析结果中，5例标本扩增失败；6例标本至少一条染色体的STR不提供信息，均为单峰；其中1例经染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis, CMA）证实为单亲二倍体。QF-PCR的总检测失败病例为11例（0.10%，11/10 967）。

（三）染色体核型正常的QF-PCR检测结果

在培养成功的10 858例产前诊断标本中，9 960例（91.73%）染色体核型结果正常。在这9 960例中，QF-PCR扩增失败5例（0.05%），6例（0.06%）至少一条染色体的所有STR位点不提供信息。QF-PCR与染色体核型分析的检测一致率为99.89%（9 949/9 960）。

（四）染色体核型异常的QF-PCR检测结果

本研究中，染色体核型异常病例共898例（8.19%），其中常见染色体异常（包括21-三体、18-三体、13-三体和性染色体异常）病例共694例（77.28%），其他染色体异常204例（22.72%）。QF-PCR与染色体核型分析在检测常见染色体异常病例时的检测一致率为95.68%（664/694）。见表1。

1.常见染色体异常：共541例。其中21-三体383例，包括21-三体嵌合体（其中1例QF-PCR结果阴性）8例；18-及13-三体分别为125例及33例，QF-PCR全部为阳性。染色体核型分析与QF-PCR技术检测21-、18-和13-三体的一致率分别为99.74%（382/383）、100.00%（125/125）和100.00%（33/33）。

2.性染色体异常：共153例，染色体核型分析与QF-PCR的检测一致率为81.05%（124/153）。分析发现，这29例QF-PCR检测结果阴性的病例均为性染色体嵌合体。

3.其他染色体异常：204例其他染色体异常病例，包括染色体结构异常115例，嵌合体87例及16-三体2例。由于本研究中QF-PCR所用试剂盒仅检测21、18、13号染色体和性染色体数目异常，未针对其他染色体设计引物，因此无法检测其他染色体异常。

（五）染色体嵌合体病例分析

本研究中，染色体核型分析结果提示141例染色体嵌合体，其中54例（38.30%）为常见染色体异常（21-、18-、13-三体及性染色体异常）的嵌合体，包括8例21-三体，1例18-三体及45例性染色体异常；另87例（61.70%）为其他染色体异常嵌合体。

在54例常见染色体异常嵌合体的病例中，24例QF-PCR提示阳性结果，包括21-三体7例，18-三体1例，性染色体16例。1例21-三体及29例性染色体异常的嵌合体采用QF-PCR检测结果为阴性。QF-PCR与染色体核型分析的一致率为44.44%（24/54）。QF-PCR对于染色体嵌合比例＞18.5%的病例的检出灵敏度为0.958（95%CI：0.789~0.999），特异度为0.600（95%CI：0.406~0.773），曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.811（95%CI：0.696~0.926），P＜0.001。见图1。

（六）随访

对染色体核型提示嵌合而QF-PCR提示阴性的30例病例的随访时间为预产期后4年（3个月~7年）。30例中，10例（33.3%）选择引产，2例（6.7%）失访，18例（60.0%）子代出生后健康存活。再次随访时，这些病例的子代年龄为2（0.5~7）岁。

三、讨论

QF-PCR具有较高的准确性和敏感性，并具有方便、快速和操作简单等优点，在主要发达国家已经广泛应用于临床。在我国，产前诊断仍处于初级阶段，相当比例的胎儿畸形直到孕中期甚至晚期才得到确诊，加上核型分析的诊断时间较长，使得很多孕妇在孕晚期面临终止妊娠的抉择。这不仅会增加孕妇的痛苦，也会增加许多产后并发症的发生率。QF-PCR技术能够为产科医生及孕妇争取最佳处理时机，同时能够更好地验证染色体核型分析的结果，是染色体核型分析技术非常有力的补充。

1. QF-PCR的结果较准确，技术重复性较高：通过回顾本中心近7年的产前诊断数据发现，传统的染色体核型分析技术的培养失败率0.99%，而QF-PCR方法检测失败率仅为0.10%，但其中有6例标本分析结果不提示信息，因此扩增失败率仅0.05%。因此可以认为，在诊断常见染色体数目异常的产前诊断标本中，QF-PCR技术更加稳定，重复性更高。

2005年，Ogilvie等[12]对英国伦敦7家遗传中心共计32 674例产前诊断病例中，孕妇唐氏综合征筛查高风险，但QF-PCR检测结果阴性的病例进行随访，结果发现，胎儿出生后发现严重临床症状的病例占0.06%~0.12%。这一结果与那些产前诊断染色体核型正常，而出生后发现出生缺陷的发生率无明显差异。因此，对于单纯的唐氏综合征高风险的孕妇，理论上可以将QF-PCR取代染色体核型分析。但是，Ogilvie等[12]在提出此结论的同时，强调如果将QF-PCR取代染色体核型分析，则需要对胎儿进行后期监测。而一项问卷调查显示，大部分的产科医生、孕妇、护士及行政人员赞成用QF-PCR取代染色体核型分析，而大部分的非孕妇及公众则倾向于选择染色体核型分析[1]。本研究通过比较染色体核型分析及QF-PCR结果发现，对于常见的染色体数目异常行产前诊断的病例，2种方法的总体一致率为99.66%（10 821/10 858），假阳性率仅0.05%。这说明QF-PCR技术在产前诊断常见染色体数目异常方面是可靠的，与国内外许多大样本临床研究基本一致，但仍有18.8%的染色体结构异常或嵌合体无法检测。因此提示QF-PCR仍不能完全取代染色体核型分析技术[13-15]。

2. QF-PCR可以很好地发现染色体嵌合现象，减少阳性：如何正确鉴别胎儿染色体嵌合现象，目前仍然是临床的一大难题。一般认为，在羊水培养中胎儿真性嵌合体的发生率为0.1%~0.3%，在绒毛培养中为0.8%[16-17]。对美国59家实验室、60 000例行羊膜腔穿刺的产前诊断孕妇统计发现，真性嵌合体发生率为0.25%，在多个细胞中出现假嵌合体的发生率为0.7%，在单个细胞中出现假嵌合体的发生率为2.47%[11]。在185例真嵌合体中，常染色体嵌合89例，性染色体嵌合73例。本研究中，胎儿染色体嵌合体比例约1.30%，其中常染色体嵌合96例，性染色体嵌合45例。本研究发现，性染色体嵌合在染色体嵌合中的比例较高，这一结果与国外研究结果基本一致[11]。

在嵌合体的检测方面，有研究显示10%以上的嵌合型染色体数目异常是完全可以被QF-PCR检测到的[11]。在Cirigliano等[18]的研究中，43 000例产前诊断样本中，72例为不同比例的21-、18-、13-三体及X单体嵌合体，其中45,X/46,XY嵌合型样本QF-PCR检测全部呈阳性，而4例标本细胞培养前核型分析结果仅仅提示为45, X，但QF-PCR结果可见到Y染色体存在。本研究中，1例21-三体嵌合体QF-PCR检测阴性，其染色体核型为47, XX, +21[10]/46, XX[90]，嵌合比例约10%。在染色体核型提示嵌合状态而QF-PCR检测阴性的30例性染色体嵌合病例中，18例出生后随访均健康存活，分析原因主要包括：（1）低比例性染色体嵌合本身临床表现较轻，与正常人区别不大；（2）QF-PCR直接检测羊水细胞，不需要培养，更能够反映羊水的真实状态；（3）QF-PCR检测阴性标本提示即使存在嵌合，其嵌合比例也较低；而染色体核型分析需要经过细胞培养，其嵌合比例并不能真实反映胎儿的实际嵌合比例。从本研究中可以看到，QF-PCR技术对于嵌合比例在18.5%以上的染色体嵌合体病例的检出率可达到95%以上。可以认为，对于产前诊断常见的染色体数目异常病例，如果染色体核型提示嵌合，而QF-PCR检测阴性，且胎儿没有任何超声结构异常，胎儿健康存活的概率较高。但这一结论仍需大样本的回顾性分析研究加以证实。

在本研究中还发现1例21号染色体的单亲二倍体。此病例产前诊断结果中，QF-PCR所有21号染色体STR位点均提示单峰，而染色体核型结果提示正常，之后样本经过CMA分析证实为单亲二倍体。此病例表明QF-PCR与染色体核型分析技术的相互结合不仅能够保证染色体核型结果的准确性，还可以检出罕见的、染色体核型分析无法检测的染色体病。

由于目前QF-PCR主要针对常见的染色体数目异常（21-、18-、13-三体及性染色体异常），所以对于染色体结构异常及其他染色体的数目异常就存在漏诊的风险。但对于产前诊断病例而言，如果其他染色体数目发现异常，胚胎早期便被淘汰而很少能继续发育至3个月，因此对于产前诊断的病例来说，其他染色体的数目异常非常少见，本研究结果也支持这一结论。898例染色体病胎儿中仅发现2例16-三体。而对于染色体结构异常病例（主要包括平衡异位、非平衡异位及染色体重组），如果胎儿超声没有发现结构异常，临床预后不良（包括智力发育受损、学习障碍、运动异常）的发生率仅5%~15%，其余85%~95%的病例可能临床预后良好[19]。

产前诊断技术经过数十年的发展，已经从原先单一的细胞诊断水平跨越到分子诊断水平。CMA技术、全外显子组测序或者全基因组测序技术在临床上的逐渐应用，不仅丰富了产前诊断技术手段，同时也增加了产前遗传咨询的难度。如何更好地将新技术与传统的产前诊断方法有机结合，已经成为临床上亟待解决的课题。对于产前诊断病例，QF-PCR技术不仅有助于快速排除常见染色体病，鉴别母体细胞污染，且有助于诊断高比例嵌合体，发现单亲二倍体，以及在双胎产前诊断中帮助鉴定胎儿源性。

3.小结：对于介入性产前诊断病例，QF-PCR和染色体核型分析技术对21-、18-、13-三体的检测一致率高于99%，而对于性染色体的检测结果差异较大，嵌合体现象是造成染色体核型分析和QF-PCR结果不一致的主要原因。因此，QF-PCR应常规作为染色体核型分析的必要且不可或缺的检测手段联合应用于临床。

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来源：中华围产医学杂志

作者：杨昕　李发涛等

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