Cell 深度| 细菌再次上演“跨界调控”，通过NO修饰宿主蛋白

撰文 | 虞莎

责编丨迦溆

微生物和宿主之间的相互作用和信息传递一直广泛受到科学家们的关注。近几年来，关于肠道微生物的“跨界调控”尤其引发了学者们的兴趣和研究热潮。仅过去一年，生命科学和医学领域的重量级期刊相继报道了肠道菌群在调控宿主的免疫系统 【1-3】、脂肪代谢【4】、癌症的发生【5,6】和免疫治疗【7】、II型糖尿病的产生【8】以及情绪障碍(Mood disorder)【9】等方面的关键作用。2018年3月，Cell杂志更是推出了微生物专刊，从多个角度诠释了微生物和宿主密不可分的共生与调控关系【10】。

已有的研究表明，生物活性分子(Bioactive molecules)可以在微生物和宿主之间进行传播和交流，影响二者自身细胞的功能以及对环境的适应性【11,12】。然而，由于微生物群体的高度异质性(Heterogeneity)以及生物活性分子的多样性(Diversity)，使得从分子水平上研究跨物种的信息交流具有一定的难度，关于不同物种中信息传递的载体以及调控机制至今并没有太多的报道。

近日，凯斯西储大学医学院和克利夫兰医学中心（Case Western Reserve University School of Medicine and University Hospitals Cleveland Medical Center）的研究人员在Cell杂志发表了题为Regulation of MicroRNA Machinery and Development by Interspecies S-Nitrosylation的文章。首次阐明了微生物释放的一氧化氮(NO)能够在宿主体内造成蛋白质的巯基亚硝基化 (S-nitrosylation)。这一跨物种的蛋白翻译后修饰影响了microRNA途径的关键蛋白——Argonaute的功能，进而导致宿主体内microRNA功能的异常，造成了宿主细胞的表达谱的变化，并最终调控宿主的生长发育【13】。

研究发现，微生物和宿主之间的信息交流可能是通过细胞的信号转导来实现，他们将研究目标锁定为气体信号分子一氧化氮。一氧化氮能够对蛋白质的半胱氨酸侧链的巯基(-SH)进行氧化，生成亚硝基硫醇(-SNO)，这一修饰称为蛋白质的巯基亚硝基化(S-nitrosylation) (图1)。

图1. 蛋白质的巯基亚硝基化(S-nitrosylation)修饰

图片来源：http://watcut.uwaterloo.ca/webnotes/Pharmacology/NitricOxide.html

S-nitrosylation是一种可逆的修饰，能够改变蛋白质的构象，影响蛋白质的活性和功能【13】。目前已有大约7000个蛋白被报道存在巯基亚硝基化修饰，包括转录因子、激酶、通道蛋白等。为了研究一氧化氮介导的跨物种信号转导，作者选择了秀丽隐杆线虫(C. elegans) 作为研究对象。线虫是研究共生细菌的一个良好的模式生物，它们以大肠杆菌 (E.coli) 或者枯草芽胞杆菌 (B. subtilis) 作为食物来源，这些细菌共生在线虫的肠道中。研究发现，由细菌产生的一氧化氮能够被线虫吸收利用，并且延长线虫的寿命【14】。那么，在线虫和细菌的共生系统中，细菌产生的一氧化氮能否对线虫体内的蛋白进行“跨界”修饰，进而影响线虫的生命行为呢？

作者采用了不含微生物的线虫野生株系N2 (microbe-free, N2 strain)，分别用两种枯草芽孢杆菌饲喂线虫：一种为野生型，另一种是一氧化氮合酶突变的菌株(Δnos)，该突变菌株不能有效的合成一氧化氮。待线虫生长到幼虫的第 4 阶段(Larval stage 4, L4)时，作者提取了线虫体内的总蛋白，并且特异的分离了巯基亚硝基化修饰的蛋白。经过质谱的分析检测，作者在饲喂野生型枯草芽孢杆菌的线虫体内鉴定到了大约1000种巯基亚硝基化修饰的蛋白，说明共生细菌分泌的一氧化氮确实能够对宿主体内的蛋白进行修饰。KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析的结果表明，这些巯基亚硝基化修饰的蛋白主要参与了能量利用以及细胞的代谢途径。

在诸多被巯基亚硝基化修饰的宿主蛋白中，ALG-1是功能较为清楚并且在高等动物中保守的一类蛋白(图2. A)。ALG-1是线虫中的Argonaute蛋白，能够同microRNA组装为RISC (RNA-induced silencing complex)复合体，调控microRNA靶基因的功能。由于Argonaute蛋白的序列和功能在高等动物中保守，作者进一步检测了哺乳动物的Argonaute蛋白之一，AGO2对外源一氧化氮的响应，发现一氧化氮也能造成AGO2的巯基亚硝基化修饰(图2. B)。蛋白质的巯基亚硝基化修饰一般只发生在一个或者几个关键的半胱氨酸的巯基上，AGO2含有22个半胱氨酸位点，作者发现只有第691位的半胱氨酸(Cys 691)是一氧化氮的作用位点。Cys 691除了在人类的四个Argonaute蛋白AGO1-AOG4中保守之外，在线虫的ALG-1中也是保守的 (对应的位点为Cys 855)，将该位点突变则会降低ALG-1以及AGO2巯基亚硝基化修饰的比例(图2. C-D)。

图2. Argonaute蛋白的巯基亚硝基化修饰以及关键的氨基酸位点

Argonaute蛋白主要包含四个结构域：N端结构域、PAZ结构域、MID结构域和PIWI结构域。其中PAZ结构域主要结合micoRNA和siRNA，而PIWI结构域负责靶基因的剪切，同时也是Argonaute和其他蛋白相互作用的区域。作者发现AGO2的巯基亚硝基化修饰位点位于PIWI结构域，毗邻AGO2和GW182蛋白相互作用的位点。AGO2和GW182的互作对于microRNA的功能起着至关重要的作用。Argonaute蛋白通过GW182招募去腺嘌呤酶复合体(deadenylase complex)、脱帽复合体(decapping complex)以及翻译起始复合体(translation initiation complex), 促进mRNA的降解并抑制蛋白的翻译(图 3) 【15】。作者发现AGO2的巯基亚硝基化修饰阻碍了AGO2和GW182的相互作用，破坏了microRNA对靶基因的抑制，这一现象在线虫中也得到了证实。

图3.  microRNA介导的基因沉默机制（图片来源：参考文献[15]）

为了进一步探究细菌介导的宿主蛋白的巯基亚硝基化修饰的作用和功能，作者利用了线虫温度敏感突变体let-7(n2853)，该突变体由于在let-7的序列中含有一个点突变，影响了let-7对靶基因lin-41的抑制作用，导致正常条件下线虫无法存活。作者发现，如果用一氧化氮合酶突变的细菌饲喂 let-7(n2853)突变体，可以在分子水平上回复let-7对lin-41的抑制，并且降低线虫的死亡率。而如果在let-7(n2853)突变的线虫中将ALG-1的Cys 855位点进行突变，使得ALG-1的巯基亚硝基化修饰无法发生，那么线虫对于细菌产生的一氧化氮的水平则不再响应。以上的证据表明，由共生细菌产生的一氧化氮能够对线虫的基因表达进行调控，这一过程正是通过一氧化氮介导的宿主蛋白的巯基亚硝基化修饰实现的。

微生物和宿主之间的生物活性分子的交流，既能够调控宿主细胞的功能，又会对微生物自身的行为产生影响。这篇文章证明了微生物的代谢产物能够对宿主的蛋白进行广泛的翻译后修饰，细菌释放的一氧化氮造成了宿主体内Argonaute蛋白的巯基亚硝基化，这一修饰位点在不同的物种中是保守的。细菌的“跨界调控”影响了宿主细胞microRNA的功能，调控了宿主的基因表达和生长发育。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.01.037

制版人：珂

1. Squarzoni, P. et al. Microbiome Influences Prenatal and Adult Microglia in a Sex-Specific Manner. Cell (2018).

2. Rothhammer, V. et al. Microglial control of astrocytes in response to microbial metabolites. Nature (2018).

3. Cremonesi, E. et al. Gut microbiota modulate T cell trafficking into human colorectal cancer. Gut (2018).

4. Fabbiano, S. et al. Functional Gut Microbiota Remodeling Contributes to the Caloric Restriction-Induced Metabolic Improvements. Cell Metab. (2018).

5. Tilg, H. et al. The Intestinal Microbiota in Colorectal Cancer. Cancer Cell (2018).

6. Thovarai, V. et al. Gut microbiome-mediated bile acid metabolism regulates liver cancer via NKT cells. Science (2018).

7. Le Chatelier, E. et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1–based immunotherapy against epithelial tumors. Science (2018).

8. Koh, A. et al. Microbially Produced Imidazole Propionate Impairs Insulin Signaling through mTORC1. Cell (2018).

9. Liu, L. & Zhu, G. Gut-brain axis and mood disorder. Front. Psychiatry (2018).

10. https://www.cell.com/cell/issue?pii=S0092-8674(17)X0006-8

11. Donia, M. S. & Fischbach, M. A. Small molecules from the human microbiota. Science (2015).

12. Shapira, M. Host–microbiota interactions in Caenorhabditis elegans and their significance. Curr. Opin. Microbiol. (2017).

13. Gould, N. et al. Regulation of protein function and signaling by reversible cysteine S-nitrosylation. J. Biol. Chem. (2013).

14. Gusarov, I. et al. Bacterial nitric oxide extends the lifespan of C. elegans. Cell (2013).

15. Sanchez, V. et al. MicroRNAs Silence Gene Expression by Repressing Protein Expression and/or by Promoting mRNA Decay. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. (2006).

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