肥胖是使得女性绝经后雌激素α受体阳性乳腺癌风险骤增的危险因素之一，但这其中的分子机制如何，人们仍不十分清楚。本文作者通过对比非肥胖，肥胖及此前肥胖后期减肥成功的女性机体的血液样本，发现游离脂肪酸可能是罪魁祸首！游离脂肪酸与雌激素α受体阳性乳腺癌细胞增殖和侵袭性增加具有相关性。在乳腺癌细胞中，游离脂肪酸靶向ERα受体和mTOR通路，重新连接代谢。靶向ERα受体和mTOR通路的PaPE-1，可阻断游离脂肪酸产生的效应。

该研究的意义在于，为女性绝经后雌激素α受体阳性乳腺癌提供了代谢上的新思路，针对ERα和mTOR信号干扰的药物或将影响及预防肥胖导致的绝经后女性雌激素α受体阳性乳腺癌。

结果：

Fig1：乳腺癌易感女性人群血浆因子的鉴定。

由于肥胖导致女性绝经后患雌激素α受体阳性—ER（+）乳腺癌的风险增加，作者采用体重指数（BMI）评价肥胖程度，从7名健康受试者（BMI<25）和8名肥胖受试者（BMI>30）中分离出原发性乳腺上皮细胞，评价其管腔和基底特性。由于标志物K18+ K14 +细胞具有较强的致瘤性，故作者采用其作为肿瘤阳性标准。图1A可见肥胖女性细胞样本中K14/K18共染细胞百分比显著高于正常组。接下来为了检验体重指数和乳腺癌风险的相关性，作者使用了来自绝经后健康对照组（健康）和收集数据时健康但后来诊断为乳腺癌（易感）组（n=40）的数据并排除或控制了年龄、种族和种族背景等混杂变量的影响。结果表明易感组配对个体的体重指数高于健康组（P=0.04）（图1B）。作者还分析了29名健康组和30名乳腺癌易感组的血浆样本，对炎症和癌症相关蛋白进行了OLINK生物标记物分析。结果显示，几种炎症相关因子（CD160、CD27、IL-12B和TNFRSF19以及肿瘤生物标志物（hK8,Nectin4, KLK13和CTSV）仅与乳腺癌易感个体的BMI相关，而与健康对照组关（图1C）。另外，血浆内两种乳腺癌相关蛋白SYND1/SCD1和TNFRSF6b的表达，易感组明显高于健康组。（图1D）。此外，通过全代谢组学分析，作者确定了25种健康组和易感组差异表达的血浆代谢物（图1E）。结果表明，与健康组相比，患乳腺癌的绝经后妇女的血浆中脂肪分解产物（FFAs）的水平明显较高，包括油酸（OA）、棕榈酸（PA）、亚油酸（LA）、硬脂酸（SA）、花生四烯酸（AA）以及甘油。（图1F）

Fig2：验证血浆因子与肥胖相关。

接下来作者重点探究FFAs对乳腺癌细胞特性的影响，验证其与肥胖相关。发现FFAs在易感人群（63名肥胖的绝经期妇女）血浆样本内表达增加（图2A）。接下来为了确定BMI对癌细胞特性的影响，作者评估了血浆样本对于ERα+乳腺癌细胞—MCF7，T47D以及ERα-细胞—MDA-MB-231中癌细胞活性的影响（图2B）。源于肥胖绝经期妇女的血浆可使ERα+乳腺癌细胞活性增加，刺激了BT474细胞系运动，激活MCF-7细胞中的mTOR通路，表明乳腺癌细胞的侵袭性增强。（图2C）此外，MCF-7细胞活力增加与肥胖组血浆内OA,PA,LA,AA的浓度呈正相关，尽管SA还未达到相关程度。（图2D）检测过程中，有21名肥胖女性减肥成功，对其血浆进行检测，FFAs水平较其初始样本显著减少。（图2E,2F）

Fig3：FFAs诱导被PaPE-1阻断的乳腺癌细胞基因表达变化

为了研究FFAs对乳腺癌细胞的影响，作者采用RNA-seq技术分析了用载体（Veh）或100nM的油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸处理的MCF-7乳腺癌细胞。（图3A）它们调节共同或不同的基因组。（图3B,3C,3D）作者在之前的研究中，发现PaPEs调节ERα-和mTOR通路相互作用，并抑制小鼠肝脏中的脂质沉积。且由于OA是乳腺癌患者血液浓度最高的FFA之一，被发现从邻近的脂肪组织中释放量最高。因此，作者选用OA来探究FFA诱导作用下的ERα-和mTOR通路，分为Ctrl组，100 nM OA处理组，100 nM OA及1µMPaPE-1处理组（图3E）后两个处理组调控了大量差异基因，也存在着部分重叠基因。（图3F）PCA分析表明，三种处理组在基因调控方面存在着明显的差异。（图3G）在集群1（C1）中，OA上调了约350个基因，其中76%的上调基因被PAPE-1阻断。另一方面，在集群2（c2）中，大约500个基因被OA下调，而PAPE-1能够恢复这些基因中约60%的表达。（图3E，3H）Go-term分析显示OA上调了糖酵解、能量储备代谢和上皮细胞迁移的相关基因。同时，OA治疗下调了谷胱甘肽和脂肪酸代谢、细胞粘附和上皮细胞增殖抑制剂相关基因。（图3I）

Fig4：FFAs激活mTOR及PI3K信号通路

既然源于肥胖个体的血浆激活了mTOR通路（图2C），并且OA上调基因集与mTORC1信号传导和PI3K通路相关（图4A），故作者用FFAs处理细胞，研究mTOR途径下游靶标P70S6K,4EBP1, Akt 和ERK1/ERK2的激活情况。（图4B）Westernblots显示OA、PA、LA和SA可使mTOR途径被稳定持续的激活，15分钟游离脂肪酸的处理所增加p70S6K磷酸化证明了这一点。（图4B）长时间的游离脂肪酸刺激可激活mTOR通路，而ERK1/ERK2的激活则是快速而短暂的，45min时出现信号后在90min又回到了基线水平。与Vehicle组相比，磷酸化的倍数变化因不同种游离脂肪酸的处理而不同。（图4B，补图3）mTOR抑制剂RAD001抑制了mTOR和MAPK下游靶点的FFA依赖性激活。然而，MEK抑制剂AZD6244只阻断ERK1和ERK2的磷酸化。（图4C）

Fig5：FFAs以ERα和CD36依赖性方式诱导细胞增殖

OA治疗降低了内皮细胞增殖抑制剂的表达（图3I），与对照组相比，细胞增殖相关基因表达上调。（图5A）OA可以上调有丝分裂细胞周期基因的表达。OA和PA处理组细胞活力显著提高。然而，当与PaPE-1联合治疗时，FFAs的效果显著降低。（图5B）为了证实OA通过ERα和mTOR途径促进了细胞增殖，作者分别在ERα受体拮抗剂Fulvestrant(Fulv)，ERα受体激动剂和mTOR途径抑制剂RAD001和PAPE-1作用的情况下，观察OA处理对细胞活性的影响。结果显示所有受试药物均阻断了OA诱导的细胞增殖，揭示了OA诱导的细胞增殖对ERα和mTOR通路的依赖性。（图5C）作者接下来探究肥胖人群血浆诱导的MCF-7细胞增殖是否通过ERα受体和mTOR通路，发现了PaPE-1是抑制血浆诱导MCF-7细胞增殖最有效的药物。（图5D左）然而，标准细胞培养条件下，4-OH-Tam 和Fulv比PaPE-1显示出了更强的抑制细胞增殖特性。（图5D右）这些结果表明，用肥胖个体的血浆治疗使MCF-7细胞更容易受到PaPE-1生长抑制作用的影响。OA和PA处理后，CD36细胞中MCF-7增加的细胞活力被抑制，其中CD36是一种向细胞导入FFA的膜蛋白。（图5E）这说明FFA需要转入细胞内促进细胞增殖。

Fig6：FFA治疗诱导乳腺癌细胞代谢重编程

基因表达分析（图3）指出OA暴露后MCF-7细胞代谢途径可能发生变化。（图6A）MCF-7细胞的代谢组学分析表明，OA处理后，糖酵解代谢产物总体增加。脂肪酸生物合成途径中的代谢物下调，胞外高水平的OA提示可能存在负反馈通路。（图6B）OA还下调了除苹果酸和富马酸外的许多TCA循环代谢物，表明苹果酸从胞质溶胶中的分流增加。（图6B）细胞代谢表型分析结果表明，在OA存在的情况下，细胞具有能量表型，增加其有氧代谢和糖酵解潜能可以更好地应对代谢应激。细胞糖酵解增加，线粒体代谢也增加，但给予PaPE-1能逆转OA诱导的糖酵解和有氧呼吸。（图6C）OA依赖性的基础呼吸，最大呼吸和ATP生成显著增加，而PaPE-1降低了这一效应。（图6D）小分子抑制剂抑制MAPK和mTOR通路可降低OA诱导的线粒体呼吸变化。（图6E）为了解代谢途径在OA诱导的细胞增殖中的作用，在给予OA的基础上，给予Etomoxir（脂肪酸氧化抑制剂）、2-Deoxy-D-glucose（2-DG，糖酵解抑制剂）、Oligomycin（ATP合成酶抑制剂）、Rotenone（线粒体呼吸抑制剂）和UK5099（线粒体丙酮酸转运体抑制剂）。所有的抑制剂都阻断了OA的作用，表明糖酵解和线粒体呼吸是OA靶向的关键途径。（图6F）

Fig7：FFA治疗诱导ERα向染色质的募集

为了检测OA治疗引起的基因表达变化是否是通过直接向染色质中加入ERα受体而引起的，作者进行了ChIP-seq实验。在OA治疗后，ERα受体被招募到新染色质位点，且大部分的招募被PaPE-1治疗阻断。（图7A）ERα受体招募存在不同的结合位点，包括PgR,CISH,和SREBP-1，最后一个位点是FA生成的调节因子。（图7B）为了解在OA存在的情况下，ERα受体向染色质募集的性质，作者进一步分析了OA诱导的ERα受体结合位点。（图7A，7C）它们源于四个基因簇C1, C2,C3, 和C4。除了C2外，没有一个簇与任何ERE有富集，这表明ERα受体可能与这些位点结合。（图7C）利用基于荧光素酶的 Cignalfinder分析系统分析了前述一些因子的转录活性。与转录因子结合位点分析一致（图7C），OA显著增加了PPAR,LXR, RXR 和EGR的转录活性。（图7D）PPARα和SREBP1的靶基因调节FFA代谢，在OA治疗后上调，显著了促进细胞增殖。（图7E）敲除MCF-7细胞中的PPARα和SREBP1，则抑制了OA和PA处理后的细胞增殖。（图7F）综上，ERα受体招募并与这些核受体协同调节基因表达，从而对乳腺癌细胞代谢起着至关重要的作用。

总的来说，本文的创新性在于发现了游离脂肪酸可能是肥胖女性绝经后乳腺癌风险骤增的罪魁祸首。其机制在于，在乳腺癌细胞中，游离脂肪酸靶向ERα受体和mTOR通路，调节代谢。而靶向ERα受体和mTOR通路的PaPE-1，可阻断游离脂肪酸产生的效应，可能成为该疾病在未来临床上的新的治疗靶点。

参考文献：

Madak-Erdogan Z, Band S, Zhao YC, et al. Free fatty acids rewire cancer metabolism in obesity-associated breast cancer via estrogen receptor and mTOR signaling. Cancer Res. 2019 Mar 12. pii: canres.2849.2018. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-18-2849

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