Nature | 为生物大分子的特异性标记提供理论基础——含炔烃氨基酸的生物合成

撰文 | 陶晓花

责编 | 兮

在过去近20年中，为了研究生物分子的功能和动力学，研究人员开发出选择性共价标记生物大分子的方法，并形成了一系列的“bioorthogonal(生物正交)”准则【1-2】。科学家们使用化学选择性标签标记非天然氨基酸的官能团，在细胞中合成掺有此类非天然氨基酸的蛋白质，从而实现蛋白质的体外和细胞中标记【3,4】。在生物学相关条件下，尤其是在蛋白质动力学、结构功能以及活体成像方面，细胞和动物的蛋白质化学选择性和快速反应性愈发凸显，而针对位点特异性蛋白标记的方法开发有望对其产生深远的影响【5,6】 (见下图)。

A用非天然氨基酸代替甲硫氨酸，在选择性压力下将非天然氨基酸特异性地掺入蛋白质中, Copyright 2010 Elsevier；B通过在不同细胞中过表达突变体氨酰基tRNA合成酶，在混合细菌培养物中对两组蛋白质进行细胞选择性代谢标记, Copyright 2012 American Chemical Society；C活体哺乳动物细胞外和细胞内蛋白质的特异性和快速标记【4】

在生物大分子的标记中应用最广泛的是点击化学(Click chemistry)，其是由化学家K B Sharpless在2001年引入的一个合成概念，主旨是通过小单元之间的碳-杂原子共价拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成【7】。点击化学中的第一个经典之作是一价铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应（Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition, CuAAC 反应）【8】。自然界中已发现的炔类天然产物约2,000种【9】，有文献报道脂肪酸去饱和酶参与聚酮化合物天然产物jamaicamide B和carmabin A的末端炔的形成【10】，但这些化合物中极少含有可用于CuAAC反应的末端炔烃。有研究人员在真菌和细菌中发现含有末端炔烃的天然氨基酸【11-13】，鉴定这些氨基酸的生物合成途径可能提供编码直接从葡萄糖原位产生含有末端炔烃的蛋白质的一般途径，并为下游正交化学反应提供机会(见下图)。

a CuAAC反应原理；b来自Streptomyces spp.的末端炔烃氨基酸；c含末端炔基的天然产物carmabin A and jamaicamide B

近日，加利福尼亚大学M.C.Y.Chang在Nature发表题为Discovery of a pathway for terminal-alkyne amino acid biosynthesis 的文章，解析了细菌Streptomyces cattleya中含有末端炔氨基酸β-乙炔基丝氨酸（βes）的生物合成途径。研究人员发现赖氨酸经历卤化、氧化C-C键裂解以及推定的丙二烯中间体形成末端炔基，此炔基可与叠氮化物发生CuAAC 型点击反应并进行下游蛋白质的大分子标记。该途径为天然存在的含炔烃氨基酸掺入蛋白质从而进行特异性标记以及各种下游应用提供了理论基础。

研究人员发现能产生β-乙炔基丝氨酸（βes）以及炔丙基甘氨酸（Pra）的土壤细菌S. cattleya，通过比较基因组方法发现了一个特定的基因簇besABCD。然后利用基因敲除实验、体外表达实验以及质谱检测等手段，发现βes的生物合成是由BesD卤化酶在Cγ位置氯化L-赖氨酸（1）引发的；然后氧化酶BesC对得到的4-Cl-赖氨酸（2）进行罕见的氧化裂解，形成4-Cl-烯丙基甘氨酸（3）；依赖PLP的酶BesB催化该中间体的γ-消除，再异构化形成末端炔烃产物Pra（4）；Pra在BesA作用下形成γ-谷氨酰二肽（5），其作为BesE羟化酶的底物，生成相应的β二肽（6）（见下图f）。由于这个基因簇中没有发现其他保守基因，因此游离的Pra和βes可能是在非途径特异性转谷氨酰胺酶或酰胺水解酶作用下释放出来(见下图)。

β-乙炔丝氨酸生物合成基因簇的鉴定及其完整生物合成途径

βes生物合成途径的鉴定产生了几种具有下游生物正交反应潜力的非标准氨基酸。为了证明这些内源性产生的氨基酸可以翻译成蛋白质，研究人员使用工程化的氨酰-tRNA合成酶（PraRS）3，以Pra的残基特异性替代Met残基，体外表达了掺入含Pra的蛋白（pPra）。利用CuAAC反应，显示炔通过内源性Pra掺入蛋白质中，此结果通过细胞提取物的蛋白质组学分析得到进一步确认。

异源宿主中共表达Pra生物合成基因（pPra），并显示内源Pra掺入蛋白质(红色箭头的掺入)

综上，研究人员鉴定和表征了含卤素，末端烯烃和末端炔烃氨基酸的生物合成途径，并鉴定了一系列代谢中间体。将这些官能团以位点或残基特异性引入肽和蛋白质，为下游各种生物正交化学方法的应用提供了机会(这些正交方法包括炔介导的CuAAC点击反应，烯烃复分解或聚合，以及可操纵的卤素依赖性反应等)。

βes途径能够酶促合成各种氨基酸，并通过一系列生物正交手段用于下游化学反应

制版人：珂

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12. Sanada, M., Miyano, T. & Iwadare, S J. Antibiot. (Tokyo) 1986, 39, 304–305.

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