Nat. Commun.：“白”加“黑”检测葡萄糖

纳米酶又称类酶纳米材料，与天然酶一样能够在温和条件下催化底物快速反应，并且在酸性或碱性条件下比天然酶更稳定，在较大温度范围内催化活性保持的更好。由于纳米酶的制备工艺简单、成本较低、稳定性强、催化活性高等优点，其在能源、催化、癌症治疗等领域被广泛用作天然酶的替代品。已知的绝大多数纳米酶只能催化一类底物，其中能够催化葡萄糖反应的纳米酶相对较少，常用的是金纳米颗粒，用于检测葡萄糖的纳米酶主要是包含金颗粒的纳米复合材料，它们利用金颗粒催化葡萄糖生成H₂O₂，然后H₂O₂与底物（比如四甲基联苯胺，TMB）反应产生颜色的变化。2018年Li Feng教授等人曾发现二氧化锰有催化葡萄糖分解的能力（Adv. Funct. Mater., 2018, 28, 1800018），同时它还能催化H₂O₂分解，性能非常类似自然界中葡萄糖氧化酶-过氧化物酶的级联酶体系，可以实现一锅法灵敏地检测血糖含量。而目前还未发现能类似级联酶体系检测葡萄糖且不含金属的纳米酶。

最近，韩国浦项工科大学（POSTECH）的Wonyong Choi教授等人发现KOH和KCl改性的石墨相氮化碳（g-C₃N₄）具有类似葡萄糖氧化酶-过氧化物酶的性能，在光照条件下能够完成级联催化反应，可用于检测葡萄糖。改性的g-C₃N₄一方面具有类似葡萄糖氧化酶的活性，可见光照射下催化葡萄糖氧化和O₂还原，生成H₂O₂，表观量子效率将近100%；另一方面还具有类似过氧化物酶的活性，在黑暗中将原位生成的H₂O₂分解，并氧化原本无色的显色底物（TMB），从而完成葡萄糖检测。基于该纳米酶设计的微流控装置能够在30 s内检测血糖含量，最低检出限为0.8 μM。该工作发表在Nature Communications 期刊上。

图1. 类似级联酶的改性石墨相氮化碳（AKCN）纳米酶。图片来源：Nat. Commun.

通常生成H₂O₂的方法主要有蒽醌法和惰性金属催化法，而光催化生成H₂O₂是通过质子耦合电子转移过程完成的，具有成本低、操作简单、对环境友好等优点，但是该过程中电子转移选择性差，在催化剂表面H₂O₂容易分解。石墨相氮化碳对H₂O₂的的吸附能力较低，可以有效避免在材料表面H₂O₂的分解，另外，石墨相氮化碳很容易进行功能化，只不过石墨相氮化碳光催化生成H₂O₂的能力较弱。曾有文章报道KPF₆掺杂的石墨相氮化碳光催化性能效果较好，在乙醇中光波长为420 nm时表观量子效率为24%。为了模拟葡萄糖氧化酶（GOx）的能力，作者也希望通过掺杂的方式来实现，在制备石墨相氮化碳时分别添加KOH、KCl或者两者的混合物，分别称为CAN、KCN和AKCN，并对产物进行了表征（图2）。由XRD、红外、EDS和XPS等结果证明在K与Cl被成功地引入到GCN框架中，并有助于层与层之间电荷的传递。

图2. 石墨相氮化碳与掺杂不同成分之后的表征结果。图片来源：Nat. Commun.

随后作者研究了该材料光催化生成H₂O₂的功能。通常结合氧还原和水的氧化反应光驱动合成H₂O₂的AQY能达到100%。由于水氧化过程效率较低，一般以醇作为电子给体，作者以KOH和KCl修饰的GCN作为光催化剂模拟了GOx（图3）。首先作者优化了制备改性GCN时KCl和KOH的比例与浓度、溶液的pH和电解质种类，并且发现KCl和KOH之间互不影响。由图3b可得，当KOH和KCl浓度处于最佳条件下，3 h内AKCN催化产生H₂O₂的量（3.4 mM）分别是KCN（1.58 mM）、CAN（0.85 mM）和无掺杂石墨相氮化碳（0.14 mM）的2、4和24倍，而AKCN的比表面积还是最小的。另外，在320-420 nm范围内AKCN表观量子效率能达到100%，这是目前在可见光范围内产生H₂O₂过程中表观量子效率最高的。

图3. GCN与掺杂不同成分之后光催化乙醇产生H₂O₂的表征结果。图片来源：Nat. Commun.

但是作者利用Tauc图和XPS结果发现掺杂KCl和KOH之后导带与价带之间只有很小的变化，这并不能解释AKCN很高的光催化能力，证明该掺杂过程除了热力学因素之外也有动力学的影响，应该是掺杂之后有利于电荷分布和转移，作者并用计算进行了证明。另外，AKCN的Zeta电位值比GCN、KCN和ACN更负，这有助于质子转移到催化剂表面与O₂反应生成H₂O₂。随后作者利用瞬态光电流响应法、电化学阻抗法等也进行了证明（图4），发现修饰AKCN的电极阻抗最小，光电流最大，说明掺杂KCl和KOH之后对GCN动力学的影响。作者还用瞬态开路电压衰减法证明AKCN的开路电压更高、光电流衰减更慢，证明AKCN表面电荷重组阻力大，有利于延长载流子寿命。

图4. GCN与掺杂不同成分之后的光电化学行为。图片来源：Nat. Commun.

AKCN在电解质溶液中光催化生成H₂O₂的过程与GOx的反应条件一致，作者发现其同样可以在可见光下催化氧化葡萄糖生成H₂O₂（图5）。在一定范围内H₂O₂的生成速率与葡萄糖的浓度成正比（图5b）。与光催化乙醇生成H₂O₂相同，催化葡萄糖的过程中表观量子效率也将近100%，并且选择性也很好（图5c）。接着作者研究了AKCN的类过氧化酶性能，发现在黑暗条件下AKCN能催化H₂O₂氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB），使溶液颜色由无色变为蓝色（图6和7），并且该催化过程符合米氏方程（图6b和6c）。作者基于该方法能实现比色检测H₂O₂，最低检出限为0.015 mM。只不过目前对该催化机理还不清楚，并且AKCN只能催化H₂O₂氧化TMB变色，不能氧化其他过氧化酶的底物变色（比如2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，ABTS）。这可能是因为AKCN表面带负电荷，不利于带负电荷的ABTS与其反应。

图5. AKCN光催化氧化葡萄糖生成H₂O₂。图片来源：Nat. Commun.

图6. AKCN光催化氧化葡萄糖生成H₂O₂的稳态动力学研究。图片来源：Nat. Commun.

基于AKCN类似级联酶的催化性能，作者还利用间歇反应器实现了比色检测葡萄糖。先在光照条件下与葡萄糖反应20 min，然后加入适量TMB在黑暗条件下反应10 min，检测溶液颜色的变化，线性范围为0.01~0.3 M，最低检出限为0.07 mM（人体血糖正常值为3~8 mM，糖尿病患者血糖含量为9~40mM）。更重要的是通过作者设计的微流控装置（图7c）可以实现30 s内检测葡萄糖的浓度，检出限降至0.8 μM。

图7. 利用AKCN的类级联酶性能检测葡萄糖。图片来源：Nat. Commun.

总结

本工作利用掺杂KOH和KCl的方式对石墨相氮化碳进行改性，发现得到的复合材料AKCN在可见光下能够催化葡萄糖氧化并产生H₂O₂，并且在黑暗条件下AKCN能直接催化H₂O₂分解并氧化显色底物，具有类似级联酶的性能。基于该材料，作者设计了一种微流控装置可以实现30 s内检测葡萄糖的浓度，检出限为0.8 μM，足够进行血糖检测。只不过目前还不清楚该复合材料的作用机理，从实验结果推测主要是因为掺杂之后改变了石墨相氮化碳的电荷分布，并有助于电荷转移。不过，这一发现还是为设计新型的纳米酶材料提供了一种新思路。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

Modified carbon nitride nanozyme as bifunctional glucose oxidase-peroxidase for metal-free bioinspired cascade photocatalysis

Nat. Commun., 2019, 10, 940, DOI: 10.1038/s41467-019-08731-y

（本文由Sunshine供稿）

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