NSMB背靠背丨黄志伟组发现新型Anti-CRISPR蛋白，并揭示其抑制type V型Cas12a活性的新机制

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CRISPR-Cas适应性免疫系统为细菌和古细菌对抗噬菌体和质粒入侵提供了核酸序列特异性的防御机制【1】。CRISPR-Cas系统分为6个亚型，其中II型CRISPR-Cas9和V 型CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统被广泛应用于基因组编辑和多种多样的生物技术应用【2,3】。在噬菌体感染细菌过程中，细菌的Cas效应蛋白Cas9或Cas12a在RNA指导下通过PAM-interacting (PI)结构域识别位于靶向双链DNA（dsDNA）的PAM序列并解旋靶向dsDNA的两条链，从而guide RNA与DNA的靶向链形成异源双链结合，然后Cas12a核酸酶结构域切割靶向dsDNA的两条链，从而抵御噬菌体的入侵。作为对CRISPR-Cas免疫系统的反应，噬菌体进化出CRISPR-Cas的蛋白抑制因子anti-CRISPR蛋白，使噬菌体能够逃逸细菌CRISPR-Cas防御系统。

4月1日，哈尔滨工业大学生命学院黄志伟教授课题组研究在Nature Structural & Molecular Biology杂志上发表了题为An anti-CRISPR protein disables type V Cas12a by acetylation的研究成果，发现了新型Anti-CRISPR蛋白，并揭示其抑制type V型Cas12a活性的新机制。

研究者首先通过生物信息学方法寻找到一类anti-CRISPR候选蛋白,接着通过生化和细菌实验发现其中的一个anti-CRISPR蛋白AcrVA5具有抑制Moraxella bovoculi (Mb) Cas12a活性的能力，但是意外的是凝胶迁移实验发现AcrVA5蛋白并不结合MbCas12a-crRNA，这个现象与以前研究发现的anti-CRISPR蛋白通过结合Cas蛋白阻止靶向DNA的结合或者阻止Cas蛋白核酸内切酶活性完全不一样，推测MbCas12a的抑制活性可能是通过一种未知的酶修饰而实现的。接着通过对AcrVA5蛋白序列分析以及进一步生化实验揭示AcrVA5蛋白具有乙酰基转移酶活性，进一步的生化实验证实AcrVA5蛋白通过乙酰化修饰MbCas12a蛋白使其失去切割DNA的能力。

接下来寻找AcrVA5在MbCas12a蛋白上的乙酰化修饰位点。这类乙酰基转移酶通常修饰底物蛋白上的赖氨酸（K）残基，由于K635是MbCas12a识别底物DNA的PAM序列的关键氨基酸，因此推测MbCas12a的K635可能是AcrVA5乙酰化修饰从而失活的关键位点。接着MbCas12a的K635R突变试验证实该突变体活性不能被AcrVA5抑制，同时发现AcrVA5对另一Mb strain (Mb2)的Cas12a（识别PAM序列的关键氨基酸是精氨酸而不是赖氨酸）没有抑制能力，表明AcrVA5蛋白发挥其抑制作用主要依靠乙酰化Cas12a蛋白PAM识别区域的K残基发挥作用的。有趣的是，Mb2Cas12a的R625K突变体的活性能够完全被AcrVA5抑制，从而该结果结合质谱分析证实AcrVA5蛋白通过修饰MbCas12a蛋白的识别底物PAM的关键K635残基使之失活。

Cas12a蛋白的结构揭示K635的乙酰化不仅使dT2和dA(3*)之间失去氢键相互作用，也可能与临近的PAM DNA形成空间位阻，阻止了dsDNA的结合，从而使Cas12a失去dsDNA切割活性。

该研究揭示的anti-CRISPR通过乙酰转移酶活性修饰并抑制CRISPR蛋白的机制和该课题组以前发现的anti-Cas9的抑制机制完全不一样，anti-Cas9是通过直接结合Cas9的底物结合位点从而抑制Cas9的活性。因此该研究首次揭示了anti-CRISPR蛋白通过酶修饰作用抑制细菌CRISPR-Cas免疫防御系统的新机制和策略，也为噬菌体和细菌免疫系统（CRISPR-Cas）之间的进攻防御策略提供了新观点。该发现可以用于在体内精确控制Cas12a的活性，提高基因编辑的精确性。这也是该团队在病原与宿主相互作用和基因编辑分子机制研究领域取得的又一重要研究成果。

图片引自NSMB杂志News & Views部分

据悉，黄志伟教授为该研究论文的通讯作者，博士研究生董立永和关晓宇，北京大学高宁组的李宁宁博士为该论文的并列第一作者。上海同步辐射中心为晶体数据收集提供了支持。

在同期杂志上，加州大学Jennifer Doudna发表了题为Broad-spectrum enzymatic inhibition of CRISPR-Cas12a的研究论文，揭示了AcrVA1, AcrVA4 and AcrVA5三种抑制因子可通过不同的机制抑制Cas12a的活性，即AcrVA1可通过触发切割Cas12a结合的guide RNA的目标识别序列，从而不可逆地失活Cas12a复合物；AcrVA5可抑制dsDNA的识别；AcrVA4除可抑制dsDNA的识别还可引起Cas12a的二聚化。

另外值得一提的是，NSMB的News & Views栏目同时对这两项研究进行了点评，指出这两项研究揭示了type V Acr蛋白可以利用酶活性关闭Cas12a的内切功能，将有利于更好的利用CRISPR技术。

事实上，两篇背靠背的工作实际上黄志伟课题组的工作较Jennifer Doudna研究组更胜一筹，Doudna研究组虽然找到了关键蛋白但是实际上并没有发现具体的机制（详见下图Doudna研究组论文中的示意图，右下角部分用？代替）。实际上，AcrVA5蛋白发挥其抑制作用主要依靠乙酰化Cas12a蛋白PAM识别区域的K残基发挥作用的。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41594-019-0206-1

https://doi.org/10.1038/s41594-019-0208-z

制版人：半夏

1. Marraffini, L. A. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature. 526, 55–61 (2015).

2. Shalem, O. et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84–87 (2014).

3. Zetsche, B. et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat. Biotechnol. 35, 31–34 (2017).

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