泊洛沙胺加多肽，破解肺部基因递送难题

囊性纤维化（cystic fibrosis）是一种遗传性外分泌腺疾病，由囊性纤维化跨膜电导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）突变导致，主要影响胃肠道和呼吸系统，造成慢性梗阻性肺部病变、胰腺外分泌功能异常等症状，造成的肺部损伤最为致命，而目前临床上没有有效的方法可以彻底治疗这种疾病。基因治疗的出现为治疗这种疾病带来了希望，但是目前针对囊性纤维化的基因治疗并不成功，最成功的利用阳离子脂质载体（GL67A）向肺部递送编码CFTR的质粒DNA（pDNA）的临床试验也只能稳定疾病，但是在分子水平无法检测到CFTR的表达，这主要是由于药物递送和基因表达维持时间短导致，因此目前急需有效的肺部基因递送体系。

图1. 纳米颗粒组装及发挥作用的示意图。图片来源：Nat. Nanotech.

此前有研究表明商业化的泊洛沙胺（poloxamine 704，T704）可以更有效地向小鼠肺部输送pDNA，这表明T704是一种极具潜力的治疗囊性纤维化的非病毒基因递送载体。但是德国慕尼黑大学Joseph Rosenecker博士领导的研究团队发现单独使用T704无法在体外将pDNA或者信使RNA（mRNA）转染进呼吸上皮细胞中使之表达相应的蛋白，这表明T704本身无法解决基因转染面临的细胞摄取、内含体逃逸和细胞核运输等问题，同时其体内基因输送能力也比此前发现的病毒载体差。为了解决这个问题，研究人员设计了提出了一个新策略，他们设计了一系列合成肽，这些肽包含3个功能域，分别是锚定域（与T704的疏水部分相互作用）、阳离子域（包装核酸并促进内含体逃逸）以及靶向域（将核酸靶向输送到靶细胞或者特殊的细胞器），他们将这类肽与T704一起与基因药物组装形成三元复合物纳米颗粒，并对肽的组成等进行了一系列的优化，最终制备一种无毒的合成肽-泊洛沙胺纳米颗粒可以显著增强囊性纤维化小鼠肺部基因药物【睡美人转座子系统，Sleeping Beauty (SB) Transposon system，SB转座子（pDNA）和转座酶编码的SB100X-mRNA】的递送，让小鼠肺部长时间高表达CFTR基因（相对于疾病小鼠），相关研究成果于近日发表在Nature Nanotechnology 上。

图2. 纳米颗粒的优化与转染机制研究。图片来源：Nat. Nanotech. 

作者首先使用了一种原型肽对纳米颗粒的组装及其促进细胞转染的机理进行了表征，发现转染效率依赖于组分的浓度、组装的溶剂/方法、转染的细胞系类型以及孵育时间。通过对人支气管上皮细胞16HBE的转染，作者发现三元纳米复合物（pDNA-TC或者mRNA-TC）的转染效率远高于T704和pDNA（或mRNA）组装形成的二元纳米复合物（pDNA-BC，60% vs 0.2%），同时还可以更有效保护其中的pDNA不被DNA酶降解，合成肽或者T704的含量增多可以使形成的纳米颗粒变小、表面更光滑。作者还发现这种纳米颗粒的转染是一个能量依赖的细胞吞噬过程，涉及多种吞噬途径，这种三元纳米颗粒还可以更有效地促进pDNA的内含体逃逸，从而促进其进入细胞质和细胞核。

图3. 三元纳米复合物的优化。图片来源：Nat. Nanotech.

随后作者通过细胞转染实验对肽的组成进行了优化，最终找到了编号为9的肽，由它参与组成的pDNA-TC的转染效率和Lipofectamine 2000（商用基因转染试剂）相当，比支化PEI高5-7倍，而mRNA-TC与Lipofectamine 2000相当，是支化PEI的10-36倍。而细胞毒性实验显示这种复合物的细胞毒性低于Lipofectamine 2000。因此作者用9号肽组成的纳米颗粒进行了后续的体内外实验。

图4. 三元纳米颗粒的体外转染研究。图片来源：Nat. Nanotech.

接下来作者研究了这种纳米颗粒在体外恢复细胞表达CFTR的能力，他们选择了有功能的SB转座子（pGM206/T6）或无功能的对照转座子（pGM206）与SB100X-mRNA进行了转染实验。结果发现优化的pGM206/T6+SB100X-mRNA可以使细胞一直维持CFTR的表达，而未优化的组合或者pGM206 +SB100X-mRNA无法使细胞长时间维持其表达。当给囊性纤维化的支气管上皮细胞转染同时表达荧光素酶和CFTR的pDNA 2周后，细胞中CFTR-mRNA的表达显著高于未处理组，对CFTR蛋白的免疫荧光染色也成功地检测到与健康细胞类似的CFTR的分布，定量分析发现转染后的细胞表达的CFTR的水平大约是正常细胞的40%。

图5. 三元纳米颗粒的瞬时转染效果及毒性研究。图片来源：Nat. Nanotech.

最后作者对这种纳米颗粒在体内转染囊性纤维化小鼠肺上皮细胞修复CFTR的能力进行了测试。作者通过气管内给药对囊性纤维化小鼠进行了治疗，24小时后取出肺进行荧光成像，发现pDNA-TC组的荧光强度显著强于对照组和pDNA-BC组，而活体成像显示其转染效果也优于常用的阳离子脂质DOTAP的转染效果，同时其转染的面积和强度显著由于其他组。体内毒性、炎症反应和病理切片数据显示TC基本不会引起血细胞数量变化，也不会引起炎症反应。为了评估这种TC系统转染后的长期基因表达，作者对小鼠进行了连续三次（5天1次）的气管内给药，两天后发现利用pGM206-fLUC-CFTR/T2和pGM206-fLUC-CFTR/T2 + SB100X-mRNA治疗的小鼠的肺都高表达了荧光素酶，两周后后者的荧光素酶的表达量是第二天时的30%-60%，而前者几乎检测不到荧光素酶的表达。对小鼠肺组织匀浆的分析显示转染18周后后者的表达量都显著高于其他组，蛋白水平和基因水平的定性定量分析结果也与成像结果吻合。随后作者通过全基因组测序对基因插入的位点进行了分析，找到了113处插入位点，对位点的进一步分析显示这种基因修饰的方法比病毒载体更安全。

图6. 三元纳米颗粒的长时间转染效果及基因插入位点分析。图片来源：Nat. Nanotech.

综上，本研究开发了一种基于多肽、泊洛沙胺与基因药物共组装的肺部基因药物递送系统并对之进行了优化，利用含有多种功能结构域的多肽解决了泊洛沙胺肺部基因转染效率不高的问题，最终有效地增强了呼吸上皮细胞的体外转染效率，实现了囊性纤维化小鼠肺上皮细胞的基因转染，成功利用睡美人转座子系统将CFTR基因高效的转输到小鼠肺上皮细胞中，实现了CFTR的高效长时间表达。其体外转染效率与商用试剂Lipofectamine 2000相当，而体内转染的效果则优于常用的DOTAP，而细胞毒性和系统毒性也优于Lipofectamine 2000和DOTAP，此外，基因插入的安全性还优于此前的病毒载体。因此这是一种安全有效的基因转染系统。此外，由于泊洛沙胺还可以在体内转染其他细胞，因此这种体系还可能用于其他细胞的基因转染或者基因编辑。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

Self-assembled peptide–poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis

Nat. Nanotech., 2019, 14, 287–297, DOI: 10.1038/s41565-018-0358-x

（本文由瀚海供稿）

点击“阅读原文”，查看 化学 • 材料 领域所有收录期刊