再创丨合成生物学简史（1961-2013）

本文将合成生物学领域的发展划分为三个不同的时期：首先是基础时期，在这个时期该领域的许多特色实验和文化特征已经确立；然后是中间阶段，特点是领域扩张，但改造技术进展滞后；最后是近来这段创新加速和应用转型的时期，新技术和新工程方法使我们能够向生物技术和医学方面的实际应用前进。

Figure 1. 合成生物学发展时间轴（1961-2005）

Figure 2. 合成生物学发展时间轴（2006-2013）

1961-1999 领域萌芽

合成生物学的根源可以追溯到1961年Francois Jacob和Jacques Monod的文章，他们通过对大肠杆菌乳糖操纵子的研究推断细胞中存在调控线路以响应外部环境。经过后面对细菌转录调控分子细节的不断挖掘，人们逐渐形成了基于程序性基因表达构建新的调控系统的设想。

随着20世纪70年代和80年代分子克隆和PCR技术的发展，基因操作在微生物研究中得到了广泛的应用，提供了人工基因调控的技术手段。然而在前基因组时代，基因工程的研究方法大多局限于克隆和重组基因表达。简而言之，基因工程还没有配备必要的知识或工具，以创造与微生物中调控网络多样性和深度相似的生物系统。

到20世纪90年代中期，自动化DNA测序技术和改进的计算工具使完整的微生物基因组得以测序，高通量RNA、蛋白质、脂类和代谢物测量技术使科学家能够解析大量的细胞成分及其相互作用。生物学家和计算机科学家将实验结合起来对细胞网路进行逆向工程，这种研究规模的扩大促进了系统生物学领域的发展。从这些繁杂而持续的研究工作中人们逐渐发现，即使细胞网络庞大复杂，但被组织成清晰可辨的功能模块层次结构时，与许多工程系统具有相似的特点。

另一方面，作为自上而下(top-down)的系统生物学方法的补充，一种自下而上(bottom-up)的方法被设想出来，这种方法可以利用不断扩大的分子元件库工程化调控网络。这种方法既可用于研究自然系统的功能组成，也可用于构建具有潜在生物技术和医疗应用价值的人工调控网络。到上世纪90年代末，一小部分工程师、物理学家和计算机科学家发现了这一机遇，开始转向分子生物学。

2000-2003：奠基之年

对于早期合成生物学家来说，构建简单的、以类似于电路的方式执行功能的基因调控线路方便易行，这些简单线路的动力学可以用简单的数学模型描述，使得线路工程师能够评估这种基于模型的设计方法的好坏。

Figure 3. 双稳态开关（toggle switch）和压缩振荡子（repressilator）

2001年1月，第一批合成线路问世。Collins和他的同事们构建了由相互抑制的转录因子组成的双稳态开关(toggleswitch)；Elowitz和Leibler设计了由三重负反馈环组成的振荡电路，导致抑制蛋白表达的有序的周期性振荡。这些线路都是由相似的元件构建而成，并使用GFP作为输出报告线路行为。而且这些线路都是基于数学模型的设计，但需要不断地迭代元件对线路进行调谐，才能使实验输出与模型一致。这些研究建立起的定量设计、物理构造、实验测量和假设驱动的调试流程，至今仍是合成线路设计的一大特征。

Figure 4. 自调节线路

同期还有一些研究使用电路工程学研究网路设计和定量行为之间的关系。这些简单的线路包括自调节正反馈和负反馈、基于弛豫(relaxation-based)的振荡器，不同的逻辑门等。简单的基因线路探索了真核和原核生物中基因表达和分子噪声间的关系，增进了我们对基础生物学的理解。

同时，第一个细胞间通讯的基因线路被开发出来，这预示着几年后工程微生物群落的发展。此外，利用将蛋白-蛋白相互作用域和支架蛋白的融合进行翻译后调控的工作也在酿酒酵母中完成。

2004-2007：扩张和“成长的烦恼”

合成生物学领域的规模和范围在本世纪头十年中期开始急剧增长。合成生物学第一次国际会议（SB 1.0) 于2004年夏天在MIT举行，促进了合成生物学社区的创建，并激励着人们朝着设计、构建和表征生物系统的方向努力，去实现全基因组工程的长期目标。

当代工程学的思想首次被注入到分子生物学研究中，引发了对两个领域兼容性的质疑：合成生物学能否发展成为一门与电气或机械工程相媲美的复杂的工程学科? 像元件标准化这样的实践及像抽象层次结构这样的概念能够映射到生物系统吗? 研究者们开始通过创建模块化的元件库，开发构建和调谐线路的方法，尝试去完善对遗传系统的改造工程。

显著突破

Figure5. 2004-2007年间重要工作示例

a| Modular riboregulator b|双输入AND gate c|多细胞pattern

这一时期，基于大肠杆菌的元件和线路设计的里程碑式研究不断出现。基于RNA的系统将合成线路的设计由转录调控拓展到转录后和翻译层次的调控（Figure 5a）。基于共转录tRNA构建出翻译层面的AND逻辑门（Figure 5b）；群感系统被进一步改造用于实现多细胞模式（patterning）；感应线路的开发可以在细胞内将光输入转化为基因表达（Figure5c）。

或许这一时期最令人瞩目的科学成就发生在代谢工程领域。通过将合成生物学正向工程的原则与几十年基础生物学对类异戊二烯的生物合成的研究相结合，实现了对抗疟药物青蒿素前体的非同源合成。随着对多酮和非核糖体多肽的理性设计领域杰出工作的涌现，合成生物学的潜在商业应用被日益重视。促进细菌对肿瘤细胞侵染的合成线路是细胞疗法的早期例子。

难以克服的障碍

研究者们整合新元件并构建复杂度更高的线路时，很快就发现有几个主要瓶颈难以突破：首先，将元件组装成复杂线路的有效方法尚未被开发出来；其次，缺乏表征遗传元件功能的方法；最后, 调谐线路的过程中，功能电路往往包含未被表征的元件，在引入这些元件时需要重新表征这些原件。

解决元件储存和装配问题的早期工作是RSBP (Registry of Standard Biological Parts), 它通过以固定的“生物砖”（biobricks）格式对基因元件进行数字编号及物理存储，以便将这些元件逐步有序的组装成更大的线路。这些“注册表”（Registry) 储存了大量的序列信息，而且通过将它们翻译成SBOL (Synthetic Biology Open Language), 为软件工具提供了一种描述合成元件和电路设计的标准格式，有利于库间的交换。OpenWetWare最初是MIT开发的一个公共wiki，现在已经发展为可以共享操作方案（protocol）和管理实验室网站的论坛。

元件表征是一个更棘手的问题。在许多情况下，即使是表征相对较好的元件，在脱离其最初表征所处的特定遗传环境时，也不能以预测的方式发挥作用，而且与其他元件一起放入电路时，它们也往往不能正常发挥作用。解决这些元件的互用性和环境依赖性问题的困难导致了复杂线路开发的相对停滞，因此合成生物学家只能继续使用相对简单的线路设计。

合成生物学开始在科学界和大众媒体上得到广泛的认可，而iGEM的快速扩张在引起大学和公众的兴趣方面发挥了重要作用。近年来，随着瑞士苏黎世的SB 3.0和中国香港的SB 4.0等会议的召开，合成生物学领域也变得越来越国际化。

2008-2013：发展提速和规模扩大

从2008年开始，复杂程度更高的线路开始被搭建出来，这些基因线路由更多表征更良好的元件组成，而且表现出更精确和多样的行为。尽管元件的环境依赖性和互用性问题仍未解决，但一些工程实践中的改进在某种程度上起到了平衡作用，提高了线路的搭建效率。

Figure 6. 2008-2013年间重要工作示例

a|Relaxation oscillator b|基于重组酶的逻辑 c|边缘检测线路 

2008年，Hasty和他的同事们开发出一种鲁棒性强、具有持续振荡特性的电路（Figure 6a）。他们将定量建模与鲁棒线路设计相结合，并且利用微流控平台对线路的性能进行了表征。随后的工作中，类似的线路结构与群感系统相结合，实现了全细菌群体的同步振荡。气相氧化还原信号系统的加入使得振荡行为拓展到厘米尺度。

2009年，一对能够计数的合成线路被报道出来。其中一种计数器电路利用重组酶介导的DNA重排产生对时间的永久记忆，类似的策略随后被用来设计了一套完整的基于重组酶的逻辑门（Figure 6b）。进而大肠杆菌中实现了鲁棒的转录逻辑的综合构建，包括16中基本逻辑门和使用多层转录级联的多输入逻辑网络。这一时期的另一项显著成就是将细菌光敏电路的能力拓展到边缘检测（Figure 6c），以及利用依赖于群感系统的鞭毛运动实现大肠杆菌的群体模式。

生物传感功能使得实现基于RNA的计算成为可能，基于RNA的线路工程也获得了发展。研究者们构建了RNA装置（device）来控制基因表达的调控逻辑，并且开发了RNA设计工具以实现对内源和外源基因靶标的精确、可预测的控制。另外，CRISPR-Cas系统也被用于实现全基因组的转录控制。Cas9的DNA结合特异性是由gRNA决定的，这使得Cas9几乎可以靶向任何基因组或外显子序列；通过将转录激活因子或抑制因子与Cas9融合，该系统可以用于调控目标基因或操纵子的转录。

应用

在这段时间内，代谢工程也得到了迅速发展。得益于基因组序列数据的急剧增加和DNA合成成本的降低，研究小组开发了合成途径的预测模型用于确定合成路线，这些模型不仅基于宿主的代谢系统，而且基于所有基于已知的和预测的酶功能。然后，工程师们就可以利用基因组挖掘发现的异种酶来填补宿主代谢系统的空白，进而对模型通路进行正向工程设计。最近在大肠杆菌中这种方法的使用获得了令人瞩目的成功，包括改变氨基酸生物合成路线，生产异丁醇、脂肪酸生物柴油和汽油，以及生物塑料1,4-丁二醇。

研究组们还开始将合成调控整合入菌株中，根据关键的代谢中间体或环境条件动态控制代谢途径。例如，利用合成开关和群感系统协调生物量的增长和乙醇的生产，利用脂肪酸感应回路调节聚乙醇的生物合成和缩合途径，从而在不积累过量乙醇的方法生产高产量生物柴油。2013年初，抗疟药物青蒿素实现了大规模生产，这是合成生物学的一个重大里程碑，这种低成本药物在无赖将挽救成千上万的生命。

其他基于应用的系统也在日渐成熟，包括噬菌体疗法和细胞疗法的发展，如工程大肠杆菌通过表达异源群感信号来识别和杀死铜绿假单胞菌或阻断霍乱弧菌毒性。持续讨论的合成生物学的安全风险，导致了最初的生物安全技术雏形出现，如可编程的细菌自杀开关，以防止工程微生物被释放到环境中。

全基因组工程

SB 1.0提出了全面控制细胞功能的目标，在这期间一些重要的工作也在推动者领域向这一目标迈进。Venter和他的同事利用突破性的DNA组装技术，创造了一个由化学合成的基因组控制的支原体细胞。合成的DNA片段在酵母体内重组后组装成支原体基因组，然后将其移植到受体细菌细胞中，产生只包含合成基因组的活细胞。Boeke及其同事在酵母中使用了类似的基因组合成方法，在化学合成两个染色体臂的过程中，它们删除了所有已知的转座子和其他不稳定元件，并在每个基因两侧包含了重组酶位点。

基因组编辑

为了实现高效的基因组操作，Church等开发了“多重自动化基因组编辑”（MAGE）平台，该平台已经被用于快速改变大肠杆菌基因组中的多个位点，包括用同义的TAA密码子替换所有终止密码子的验证。细菌CRISPR-Cas系统也被用于在细菌和酵母中作为基因组编辑工具，其中细胞通过同源重组用共转化的DNA序列替换目标基因序列，然后RNA定向的DNA裂解被用于选择细胞。

挥之不去的挑战

元件和线路对周围基因环境的依赖仍然是基于模型的线路构建的障碍。生物分子线路的设计本质上仍然是一门“手工工艺”，无法实现其他工程学科所特有的可预测性设计和快速迭代。虽然有一些成功的生物物理建模的案例（如RBS计算器），但人们也逐步接受在复杂的细胞环境中的工程改造总存在固有的变量。

研究人员们试图通过生成大型的元件库并进行详细测量来量化元件行为，去控制或规避这种变量。复杂电路可以由选定的元件组合装配，然后并行筛选，挑选具有期望行为的线路进行应用或进一步优化。BIOFAB (International Open Facility Advancing Biotechnology)开展了一项工作，建立和表征大型的细菌启动子、RBS和终止子库。通过在广泛的遗传背景下测量每个部件的行为，BIOFAB开发了元件的“可靠性评分”，用于帮助识别线路设计和调试阶段的潜在缺陷。

另一种思路是降低遗传复杂性，这是变量的主要来源。一种策略是完全重新编码目标基因和整个操纵子，以去除所有未被发现的调控元件（如mRNA二级结构和小RNA）。这种“重构”方法被用来重新编码噬菌体T7, 并在大肠杆菌中重建Klebsiella oxytoca的固氮系统。另一种策略是通过基于CRISPR和核酶的绝缘系统，切割基因两侧靶位点的mRNA，消除5'UTR和共转录基因的影响。

未来展望

建立十多年以来，合成生物学领域发展显著，涌现了许多引人注目的成就。随着设计-检测循环更少地依赖于传统的分子生物学工具，而更多地依赖于DNA合成和高通量装配方法，合成生物学前进的步伐必将加快。在不久的将来，生物线路工程师的工作流将不再受到制造速度的限制，而是受到他们分析线路行为并将数据纳入下一个设计周期的能力的限制。

由于元件的表征和互用性的问题尚未解决，因此增加测试范围和多样性也很有必要。此外，还需要开发能够快速筛选或选择所需线路功能的新技术和新实验方法。合成生物学将更少的依赖于与其他工程学科的理论和实践的类比，而将建立自己的特征和文化。

随着合成系统越加复杂，他们与内生系统之间的相互作用也越来越明显。生物线路工程师需要开发出一些方法，减轻合成系统对微生物宿主带来的不同的、往往是沉重的生理负担，这或许可以借鉴代谢工程的经验。在代谢工程中通量平衡分析（flux-balance analysis）已经被用于克服类似的障碍。

合成电路的设计将(而且应该)越来越强调实际应用基因线路路的能力。在代谢工程的背景下，工程线路与细胞系统相互作用用于动态控制代谢通量，是一个迫在眉睫的挑战。另一个挑战是开发细胞疗法，使工程微生物与人类肠道微生物群结合，以对抗感染病和慢性疾病。

尽管线路设计和构造方法不断发展，但由于大多数合成网络在构建之后从未在实验室之外使用过，因此不同的研究小组之间很少共享线路设计。在某种程度上这是可预料的，因为很多线路都是用于证明原理（proof-of-principle）的设计，但是随着这个领域不断趋向复杂的、基于应用的设计，一个重要的文化转变将会产生，因为团队的研究将需要建立在其他人的工作基础之上。因此，继续促进一个包容合作的社区文化的发展，将是不可或缺的。

参考文献：

[1] CameronD E , Bashor C J , Collins J J . A brief history of synthetic biology[J].Nature Reviews Microbiology, 2014, 12(5):381-390.