时间短、样品多、起量低，我该怎么构建 DNA 文库？

今天怎么这么背，每件事情都失算，

只想用机械打断法做个核酸样本片段化，

却在转移时把样本混淆了，

时间有限，样品不少，实验无法按预计完成……

谁能告诉我该怎么办？？？

相信 NGS 测序小伙伴，或许也跟小编一样为此烦恼过。随着 NGS 测序技术的不断普及以及实验室样本通量的不断上升，使用者对流程的简化及自动化的兼容性要求越来越高。物理超声打断需要有专门的仪器及耗材，且相当昂贵，打断完成后需要进行转管操作，会损失原始 DNA 模板，尤其在低起始量 DNA 文库的构建时尤为明显。

试想一下你手里有几十个样本要做片段化处理，而实验室里几年前购买的设备一次仅能处理一个样本，而老板又没有经费预算再采购一台高通量的 Covaris，此时可能你想死的心都有了。

鉴于上述诸多因素，科学家们开始考虑内切酶打断的方法来片段化基因组 DNA，而市面上也有各种酶切打断的试剂盒相继涌现。

毫无疑问一提到酶切打断，大家都会在其随机性、是否适合 FFPE 样本，以及 gDNA 溶液的兼容性等方面产生顾虑。而相较于市面上其它厂牌的酶切打断试剂盒，安捷伦最新推出的 SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒则拥有更多亮点，帮助大家解决对酶切方法的诸多顾虑。

▶ 亮点 1：在文库质量方面具有更高的覆盖率和复杂性

酶切法相对于机械剪切由于样品损失极少，产率会更高且文库质量更好。在文库质量方面，安捷伦 SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒在新鲜冷冻和 FFPE 样品中表现出相同或更高的覆盖率（图 1）及更高的复杂性（图 2）。

图 1. 与机械剪切工作流程相比，SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒可提供更好的 100x 碱基覆盖率。利用试剂盒或 Covaris 仪器对从新鲜冷冻和 FFPE 样品中提取的 10 ng DNA 进行剪切打断。FF 和 FFPE 1（DIN = 2.7，ddCq = 1）为子宫样品。FFPE 2 为喉肿瘤样品（DIN = 2.3，ddCq = 2）。使用 Agilent TapeStation 确定所有样品的基因组质量（DIN），并用安捷伦 NGS FFPE QC 试剂盒确定 FFPE 样品质量（ddCq 值）。利用 SureSelectXT HS 试剂盒和 ClearSeq 综合癌症研究基因组合进行文库构建和靶向序列捕获。在 Illumina HiSeq 2500 上对文库进行测序 (2 × 100 bp)。将读出序列比对至 hg19，归一化为 1000X 原始测序深度，然后测定 100X 碱基覆盖率。

图 2. 与机械剪切工作流程相比，SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒可得到更高的文库复杂性（HS 文库大小）。利用 SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒或 Covaris 仪器对从新鲜冷冻和 FFPE 样品中提取的 10 ng DNA 进行剪切打断。FF 和 FFPE 1（DIN = 2.7，ddCq = 1）为子宫样品。FFPE 2 为喉肿瘤样品（DIN = 2.3，ddCq = 2）。使用 Agilent TapeStation 确定所有样品的质量（DIN），并用安捷伦 NGS FFPE QC 试剂盒确定 FFPE 样品质量（ddCq 值）。利用 SureSelect XT HS 试剂盒和 ClearSeq 综合癌症研究基因组合进行文库构建和靶向序列捕获。在 Illumina HiSeq 2500 上对文库进行测序（2 × 100 bp）。将读出序列比对至 hg19，归一化为 100X 原始测序深度，然后测定 HS 文库大小。

▶ 亮点 2：简单化一的程序应对广泛样本类型与样本质量

SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒一个程序应对各种 CG 含量样本、不同类型样本（血液、新鲜冷冻组织、FFPE 样本等），以及不同质量的样本。无需针对不同样本类型或样本质量修改或重新摸索最优程序。

图 3. SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒对质量不同的 DNA 样品可产生相似的 DNA 片段化模式。利用 SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒，在 37 °C 下对提取自不同质量 HapMap、新鲜冷冻组织和 FFPE（参见表 I 的详细信息）的 10 ng DNA 酶解 15 分钟。使用 Agilent TapeStation 确定所有样品的基因组质量（DIN），并用安捷伦 NGS FFPE QC 试剂盒确定 FFPE 样品质量（ddCq 值）。利用 SureSelect XT HS 试剂盒构建文库，并用 Agilent DNA 1000 方法在 2100 生物分析仪上进行分析。

▶ 亮点 3：同一程序应对不同起始量样本，无需调校程序

SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒一个程序应对从 10~200 ng 大跨度起始量的 DNA 样本。无需根据不同的起始 DNA 量优化和调整实验程序。 

图 4. SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒针对各种 DNA 起始量，可产生高度一致的 DNA 片段谱。利用 SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒，在 37 °C 下对提取自新鲜冷冻肺肿瘤样品的 10 至 200 ng DNA 酶解 15 分钟。利用 SureSelect XT HS 试剂盒构建文库，并用 Agilent DNA 1000 方法在 2100 生物分析仪上进行分析。

▶ 亮点 4：对 EDTA 的超强容忍度，无需额外纯化步骤

SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒对不同的 DNA 缓冲液条件不敏感，从而省略了其他酶剪切方法所需的纯化或中和步骤。分别保存在 Tris、0.1 × TE（10 mmol/L Tris、0.1 mmol/L EDTA，pH 7.5）和 1 × TE（10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA，pH 7.5）中的 DNA 可以产生高度相似的 DNA 片段谱（图 5）。

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图 5. SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒可用于不同的 DNA 缓冲液，并显示了高度相似的 DNA 片段谱。将从新鲜冷冻组织中提取的 10 ng DNA 作为起始样品。将其分别保存在 Tris、0.1 × TE（10 mmol/L Tris、0.1 mmol/L EDTA，pH 7.5）和 1 × TE（10 mmol/L Tris、1 mmol/L EDTA，pH 7.5）中。将 DNA 样品进行剪切并用以下方法进行文库制备：A. SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒和 SureSelect XT HS 试剂盒。B. Kapa HyperPlus 试剂盒。将 Tris 和其中一个 1 × TE 样品在没有活化溶液的情况下进行酶解。在有活化溶液的情况下对 0.1 × TE 和其他 1 × TE 样品进行酶解。对保存在 1 × TE 中且在没有活化溶液的情况下酶解的 DNA，观察到片段化受到完全抑制（橙色线）。由 Agilent TapeStation D1000 ScreenTape 分析方法分析片段化 DNA。

SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒的其它亮点还包括从低质量的 FFPE 样本中获得的假阳性数据的量更少，以及更少的 C 到 T 的突变。在对 GC 含量不同的样本酶切时有很好的随机性（图 6）。该试剂盒支持 SureSelect XT HS 和 SureSelect XT 低起始量建库试剂，实现快速的无需机械打断的文库构建。

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基于酶切的片段化方法不受制于实验实样本通量的变化，从低通量到超高通量皆轻松应对；而时间上相较机械打断法所需的手工操作时间更短；几乎不需要硬件设备的投入。基因组 DNA 的酶切片段化方法也许在不久的将来会成为二代测序文库构建中的主流片段化方法。

如需获取安捷伦这款产品报价或详细产品资料，请发送《二代测序建库新法宝 —— 基因组 DNA 酶切片段化》，至邮箱 genomicsgroup.china@agilent.com，并留下您的姓名、电话、单位信息。

文章来源：安捷伦

题图来源：站酷海洛

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